虚拟筛选、同源建模和分子对接是广泛应用于药物研发的常用方法，不仅可以用于药学领域，对于临床和基础医学的老师，在自己的文章内容中加一部分蛋白结构和小分子药物结合的分析内容，也会给文章加分，让研究更出彩。下面要介绍的案例就是利用化学信息学方法结合验证实验发现小分子拮抗剂的常用套路，快来了解一下吧。
TRPV3（瞬时受体电位香草酸型通道第三亚型）与伤害性感受、热感受等重要生理功能密切相关，发现靶向TRPV3通道的选择性小分子拮抗剂对深入研究TRPV3通道的病生理功能和促进TRPV通道的基础研究和新药靶点研究具有重要的意义。该研究基于配体的虚拟筛选和生物活性评价发现了新型的TRPV3选择性拮抗剂：V-39。
由于TRPV3晶体结构尚未解析，TRPV3与拮抗剂的活性结合位点尚未确定，因此选择了基于配体的虚拟筛选。基于配体的虚拟筛选可以快速地评估数百万个分子，基于已知拮抗剂的结构，通过形状/静电匹配方法发现新型的选择性TRPV3拮抗剂。小分子配体和受体之间的结合相互作用可能导致受体的活化或抑制。为了发现受体调节剂及其结合构象，在此使用TRPV1的晶体结构作为模板，通过同源建模建构了TRPV3单体模型。本研究中发现的TRPV3选择性拮抗剂和TRPV3与拮抗剂的结合模式将有助于开发基于TRPV3调节的治疗药物。
研究思路
1、第一轮虚拟筛选与生物活性评价
第一轮虚拟筛选选择了Specs化合物库，共约27万个化合物，基于已知拮抗剂结构的问询式对Specs化合物库进行ROCS形状相似的高通量虚拟筛选，运用EON将打分排名前10%的化合物进行静电匹配，最后将EON打分排名前1%的化合物进行筛选和生物测活，根据化合物骨架和化学属性的相似性，作者采用Pipeline Pilot and Cluster进行分类分析，最终挑选出36个化合物进行生物活性测试。
经过钙荧光FlexStation实验，发现3个化合物对TRPV3具有拮抗作用，分别为V-13、V-16和V-29。
了进一步确定这3个化合物对TRPV3的拮抗作用，采用全细胞膜片钳技术对表达TRPV3的HEK-293T细胞进行电生理实验，电生理实验结果显示，V-29显著抑制了2-APB激活TRPV3的电流，而另外两个化合物V-13和V-16并未表现出抑制作用。
为了评价化合物V-29对于其他热敏TRP通道蛋白的选择性，分别对TRPV1、TRPV2、TRPV4、TRPA1和TRPM8离子通道进行钙荧光实验，化合物V-29对其他的热敏TRP离子通道并没有表现出抑制作用，说明化合物V-29是TRPV3的选择性拮抗剂。
2、 同源模建和分子对接
选择已解析出来的TRPV1的两个结构作为模板，基于知识的序列比对构建TRPV1单体模型，将4N5Q替代了相应的模建ARD区域，最终构建出TRPV3单体模型：TRPV3_HM4。
2-APB是TRPV3的强效激动剂，被作为工具化合物广泛地应用于激活TRPV3，将化合物V-29和2-APB分别与TRPV3_HM4进行对接。对接结果显示，相比于2-APB，化合物V-29更加深入到该活性口袋中(图5)，可见化合物V-29通过竞争性地占据2-APB与TRPV3的作用部位从而起到抑制TRPV3的效果。因此,2-APB与TRPV3相互作用的位置可能是TRPV3与其选择性拮抗剂相互作用的活性口袋。
3 、第二轮虚拟筛选和生物活性评价
基于第一轮的虚拟筛选结果和相互作用分析，进行了第二轮的虚拟筛选。经过形状和静电匹配，最终筛选出63个化合物进行初步的生物测活，钙荧光FlexStation实验表明其中17个化合物对TRPV3具有抑制作。为了进一步验证这些化合物对于TRPV3的抑制作用，采用全细胞膜片钳技术对表达TRPV3的HEK-293T细胞进行电生理实验。这3个化合物V-39、V-46和V-53对2-APB激活的电流的显著抑制作用(图6、7)，可见这3个化合物确实是TRPV3的拮抗剂。这3个化合物V-39、V-46和V-53对其他的热敏TRP离子通道并没有表现出抑制作用，说明V-39、V-46和V-53是TRPV3的选择性拮抗剂。
通过基于配体的虚拟筛选和生物测活验证，发现了4个全新结构的TRPV3选择性拮抗剂V-29、V-39、V-46和V-53。该研究不仅提出了TRPV3与其拮抗剂的相互作用模式，同时也指出了在化合物V-39结构基础上进行优化从而得到TRPV3更加强效的选择性拮抗剂的可能性。
4、TRPV3关键氨基酸残基和潜在的活性口袋
采用了InducedFitDocking进行分子对接，对接结果表明相互作用的活性口袋可能位于linker(N末端和TM1)和TRPBox之间。化合物V-39和该活性口袋的氨基酸残基具有π-π堆叠和氢键相互作用，化合物V-39的苯环和氨基酸残基His-310的咪唑环具有π-π堆叠相互作用(图10)，V-39四氢吡咯环上的氨基作为氢键供体，与His-314的咪唑环上的N-3具有氢键相互作用，V-39的羟基作为氢键供体，与Arg-577的羰基氧具有氢键相互作用。
分子对接结果表明，化合物V-39通过图10所示的方式与TRPV3相互作用。其中化合物V-39和2-APB显示出一些结构相似性，它们都拥有两个芳香基团和三键交汇形成的大基团。不同的是，2-APB比V-39少了一个环状基团，这可能是其较低结合稳定性的原因。在未来的结构修饰中，可延长化合物V-39的-OH取代基或在四氢吡咯环上的氨基位置引入更好的氢键供体，以增强其对TRPV3的抑制作用。
5、小结
本研究基于配体的虚拟筛选和生物活性评价发现了新型的TRPV3选择性拮抗剂。采用目前已知的TRPV3拮抗剂结构生成问询式，基于形状和静电匹配,对Specs和PKU-CNCL化合物库进行虚拟筛选。在第一轮虚拟筛选中发现了新型的TRPV3选择性拮抗剂化合物V-29。在第二轮的虚拟筛选过程中采用V-29和最新报道的TRPV3选择性拮抗剂(Ab-9)生成问询式进行虚拟筛选。最终得到最具潜力的TRPV3选择性拮抗剂V-39。基于精确的序列比对，以TRPV1晶体结构为模板，构建了TRPV3单体模型TRPV3_HM4，并进行了结构验证表明该模型的合理性。分子对接的结构表明TRPV3与其拮抗剂相互作用的活性口袋可能位于linker区(N末端和TM1)和TRPBox之间，化合物V-39与该活性口袋的氨基酸残基具有π-π堆叠和氢键相互作用。TRPV3_HM4的关键性残基为His-310、His-314和Arg-577,TRPV3_HM4可用于进一步研究TRPV3结构、功能及其与调节剂相互作用机制。
参考文献
[1] 沈燕君，张新然，基于虚拟筛选、分子对接和生物测活的TRPV3 选择性小分子拮抗剂的发现，<药学学报>,2018,53 (6): 966 −975.
文章作者：宇道科研小助手
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