文章来源：中华神经科杂志, 2018,51(11) : 857-862
作者：王柠 赵淼 陈万金
摘要
神经系统遗传病种类繁多，至今大多不可治愈。随着分子生物学技术的不断发展，基因增补、外显子跳跃、增强剪接、动态突变修正、毒性表达产物清除等基因治疗策略在神经遗传病的治疗中具有良好的应用前景。
一、基因增补
基因增补是将目的基因导入病变细胞，使其表达产物弥补基因功能缺陷，从而达到改善表型、治疗疾病的目的。早在1991年，研究人员直接将装载有人源dystrophin基因的质粒直接注入迪谢内肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠模型的肌肉中，但这种方法效率极低[1]。为尽量缩小dystrophin基因的有效长度和感染效率，研究者们用AAV装载人源dystrophin小基因（minidystrophin），替代全长dystrophin，导入DMD模型小鼠肌肉中，使肌萎缩得到了改善[2]。也有研究者利用AAV病毒导入激活素ⅡB受体阻滞剂，从而抑制肌骨素，提升骨骼肌的数量和力量[3]。但在临床试验中，AAV病毒引发了患者异常T细胞免疫反应[4]。与AAV相似，慢病毒介导的成体治疗也面临致瘤性等安全问题。
基因增补技术在脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）中也得到了较好的应用。2010年，Passini团队应用包含全长运动神经元生存基因（Survival Motor Neuron, SMN）cDNA的自身互补腺相关病毒（self-complementary adeno-associated AAV，scAAV）对新生SMA小鼠进行侧脑室注射，使其寿命由14 d延长至157 d[5]。scAAV比普通AAV的表达时间更早，且能通过血脑屏障，因此后续的团队多采用scAAV进行研究。在此之后，不同研究团队针对scAAV9的不同给药方式做了大量研究，静脉注射、腓肠肌肌肉注射等，能不同程度地提升SMN蛋白表达、运动功能、神经肌肉形态和生存期[6]。但是不同给药方式和给药剂量都在很大程度上影响了最终的治疗效果，因此，探索最佳的给药方式和给药剂量是临床试验的重要前提。在非人灵长类生物中，研究人员用腰椎穿刺的方式，在猕猴体内尝试使用低剂量注射scAAV9-SMN（仅为小鼠静脉给药量的1/10）,发现猕猴的感染效率优于小鼠[7]。目前，静脉给予scAAV9-SMN治疗Ⅰ型SMA患者的Ⅰ期临床试验已完成（NCT02122952），结果显示患者的生存期得到延长，运动功能也有较大改善[8]。
除AAV之外，慢病毒介导的基因增补联合干细胞移植技术也备受瞩目。肾上腺脑白质营养不良（adrenoleukodystrophy，ALD）是X染色体上ABCD1基因突变导致ALD蛋白缺陷所引起的致死性脱髓鞘疾病。传统的ALD治疗策略是异体造血干细胞移植，但只对早期的神经变性有效。研究人员尝试分离患者CD34+细胞，用慢病毒使其感染正常的ABCD1基因，待其表达正常的ALD蛋白后，将这些基因改造过的造血干细胞对患者进行自体移植。结果显示，患者体内的ALD蛋白水平得到显著提升，影像学上也表明，治疗12个月后，患者脑白质的脱髓鞘病灶得到明显的控制[9]。该治疗已通过三期临床试验（NCT01896102）[10]。
二、外显子跳跃
外显子跳跃的目的在于破坏成熟mRNA中发生移码突变的外显子，重新获得无框移突变的、截短的、有功能的蛋白。利用反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，AONs）与mRNA互补的空间位阻作用，破坏剪切位点或外显子增强子区，即能实现外显子跳跃。大量体外实验证明，AONs能使患者[11]、DMD小鼠[12]以及DMD金毛猎犬模型[13]的肌细胞恢复dystrophin蛋白表达量。2003年，一种经过化学修饰的反义寡核苷酸2OMeAO首次被运用在DMD小鼠模型中，研究者发现肌肉注射2OMeAO即可提高dystrophin蛋白的表达量[14]。同样，另一种更稳定的磷酸二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomer，PMO）也被运用于DMD小鼠，尤其是经改造后的PMO（B-MSP-PMO），更大程度地提高了dystrophin的表达[15]，然而在非人灵长类动物上的实验中证明其具有一定的毒性[16]。目前PMO治疗已通过Ⅱ期临床试验（NCT00844597）[17]。随后，另一类PMO——Eteplirsen也显示出其优越性，它针对dystrophin基因前体mRNA进行封闭，从而使突变的第51号外显子发生跳跃。该方法也已完成Ⅱ期临床试验（NCT01540409），结果表明，Eteplirsen的确使得51号外显子突变的DMD患者产生了新的有功能的dystrophin蛋白[18]。研究者们也利用AAV病毒介导的U7和U1核内小RNA（small nuclear RNA）表达反义核酸序列，对DMD小鼠模型的第23号外显子区进行封闭，分别能在注射后3个月和18个月后看到截短的有功能的dystrophin蛋白表达[19,20]。
AONs治疗固然具有治疗前景，但AONs在不同组织的吸收效率不同，其毒性作用也不可避免，而且患者必须终身注射AONs，这些局限性促使科学家们进一步探索一劳永逸的基因治疗策略。自2013年起，成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）基因编辑技术迅猛发展，为诸多遗传病的治疗带来了希望。2016年，Science期刊同期发表了3篇利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现DMD外显子跳跃的文章，掀起了热议[21,22,23]。采用CRISPR/Cas9技术对DMD进行外显子跳跃治疗的优势在于，它不需要导入模板DNA进行修复，其所致的非同源末端连接（nonhomologous end joining）可高效地发生在所有细胞。Wagers团队和Gersbach团队利用AAV病毒装载SpCas9或SaCas9，与特异小向导RNA（single guide RNA，sgRNA）一起，采用胫前肌局部注射的方式，破坏成年DMD模型小鼠第23号外显子区的移码突变，使dystrophin蛋白的表达量得到恢复，病理性的肌肉假肥大现象也得到缓解。另外，采用静脉注射的方式还可提高心肌、膈肌、腹肌的dystrophin表达量，能有效预防DMD早产儿的死亡。科学家也对AAV9的给药部位和给药时期进行了比较，出生后1 d进行腹腔注射，出生后12 d进行肌内注射，出生后18 d进行眶内注射，这些方法均能一定程度地维持心肌和骨骼肌的dystrophin蛋白量。除直接成体治疗以外，CRISPR/Cas9技术也可与干细胞疗法相结合，达到治疗目的。由于约60%以上的DMD致病突变均发生在dystrophin基因第45~55号外显子区[24]，因此，Pyle团队将DMD患者成纤维细胞重编程成为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），运用CRISPR/Cas9技术对第44号内含子与第55号内含子区设计sgRNA进行切割，成功敲除近500~700 kb大片段。经外显子跳跃后得到了无移码突变的截短的dystrophin基因，科学家们设想，今后可将经过此类基因编辑的iPSC进行自体移植，挽救DMD患者[25]。
三、增强剪接
对于体内任何一个基因，在前体mRNA变成成熟mRNA的过程中，需要进行可变剪接，可以通过增强剪接来调控mRNA的表达水平，从而达到治疗疾病的目的，最经典的例子为SMA。对于SMA患者而言，SMN1基因缺失、SMN2保留，SMN2基因仅能产生10%的全长SMN蛋白，是由于SMN2基因的7号外显子中C>T突变使得外显子剪接增强子（exonic splicing enhancer）变为外显子剪接沉默子（exonic splicing silencer），从而使SMN2的前体RNA在剪接过程中大部分发生7号外显子跳跃，产生截短mRNA并翻译出不稳定的SMN蛋白。此外，在SMN2基因7号内含子区存在的内含子剪接沉默子（intronic splicing silencer N1，ISS-N1），是已发现的最为重要的剪接抑制因子，它包含2个异种核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）A1/A2结合位点。hnRNP作为关键的反式作用因子，是影响剪接功能的重要结构。因此，靶向设计一段反义寡核苷酸序列，与hnRNP A1/A2竞争性结合剪接沉默子，可以使7号外显子在剪接过程中得以保留。Hua等[26]通过大剂量皮下注射2′-MOE修饰的ASO（ASO-10-27），使重型SMA小鼠的生存期延长25倍。如今，nusinersen（商品名spinraza）是靶向于ISS-N1位点的反义核酸药物，已通过Ⅲ期临床试验，作为全球首个获得美国食品与药品管理局批准的SMA治疗药物，为众多SMA患者带来希望。但遗憾的是，spinraza还未引进中国，且价格昂贵，并有1/3的患者未见确切疗效。另一个位点ISS-N2也受到学者们的关注，该位点经过2′-MOE ASO干预后，全长SMN mRNA和蛋白水平明显提高[27]。另外，SMN2基因6号内含子存在Element 1区域，也参与抑制SMN基因正常剪接。经改良PMO修饰的ASO——E1MOv10和E1MOv11，能够针对Element1位点进行封闭，尤其是E1MOv11，经侧脑室注射，使SMAΔ7小鼠的生存期延长至120 d以上[28]。SMA与DMD的治疗策略既有区别又存在联系，治疗SMA需要尽量增加目标外显子区的表达量，而DMD却需要跳跃致病的外显子区，但两者均可以通过ASO特异性封闭目标区域来达到治疗效果。
四、动态突变修正
亨廷顿病、脊髓小脑共济失调（spinal cerebellum ataxia，SCA）、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和脊髓延髓肌萎缩（spinal bulbar muscular atrophy）等发病机制类似，都是由于异常CAG动态突变，导致出现多余的多聚谷氨酰胺链（poly Q），造成毒性蛋白蓄积[29]。亨廷顿病的致病基因是huntingtin基因，正常人的huntingtin基因1号外显子区有8~25个CAG重复序列，而亨廷顿病患者却存在高达35个CAG重复序列，从而产生异常huntingtin蛋白[30]；SCA中最常见的类型是SCA3，其致病基因是ATXN3，正常人的ATXN3基因有12~37个CAG拷贝，而SCA3患者却有61~84个CAG拷贝[29]。对于动态突变，科学家们首先尝试了RNA干扰治疗策略[31]。对于亨廷顿病，研究者们分别运用不同干扰RNA对异常huntingtin蛋白进行敲减。Kanazawa和Davidson团队分别用siRNA和AAV1-shRNA针对亨廷顿病R6/2鼠和亨廷顿病-N171-82Q小鼠进行干预，干预后亨廷顿病小鼠神经元内异常huntingtin蛋白的表达量以及核内异常包涵体明显下降，小鼠的运动行为能力也得到改善[32]。对于SCA3，针对ATXN3基因3′端非翻译区设计siRNA，并通过AAV1导入SCA3小鼠的小脑深部核团，这种方法减少了异常ATXN3蛋白的聚集[33]。RNA干扰的敲减作用比较局限，只能抑制部分异常的蛋白。相比而言，ASO能更彻底地针对目标基因序列进行封闭。通过对BACHD和YAC128两种不同亨廷顿病小鼠模型以及猕猴进行鞘内滴注，ASO能显著降低异常huntingtin蛋白，并在一定时间内维持正常功能，ASO对疾病的逆转和控制效果优于干扰RNA[34]。
强直性肌营养不良（myotonic dystrophy，DM）是欧洲人群中最常见的致死性单基因遗传病，其分为两型——DM1和DM2，致病机制分别是DMPK基因非编码区3′端CTG动态突变和ZNF9基因1号内含子区CCTG动态突变[35]。以DM1为例，转录产生多余的CUG序列可能阻挡了RNA结合蛋白的表达，导致剪切异常。因此，设计人工位点特异性RNA外切酶（artificial site-specifc RNA endonucleases，ASREs），靶向针对CUG重复序列进行切割，结果发现，DM1患者成纤维细胞中异常DMPK mRNA水平降低40%。相似地，对DM1小鼠模型皮下注射2′-MOE和2′-4′-cEt修饰的ASO，异常DMPK mRNA水平分别下降66%和41%。由此可见，ASO比ASREs方法表现了出更好的疗效[36]。此外，研究者们运用CRISPR/Cas9技术，联合4个sgRNA，对DM1患者的肌细胞进行基因修复，成功敲除了大片段CAG重复序列，为这类疾病带来了新的希望[37]。
五、毒性表达产物清除
腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）是最常见的遗传性周围神经病之一，其分类有数十种，已知的致病基因已超过40个。CMT1A为最常见的亚型，大部分患者是由于PMP22基因重复突变所致。PMP22基因大片段重复导致PMP22表达量增加近50%[38]，过多的PMP22表达产物可能导致神经脱髓鞘。Zhao等[39]大规模筛选PMP22基因的ASO序列，对CMT小鼠进行皮下注射，结合RNA-seq技术，敲减PMP22基因后，相关的脂代谢和髓鞘基因表达量显著升高，而髓鞘抑制基因和施万细胞去分化的标记基因表达下降，说明对PMP22的抑制可以促进髓鞘发挥正常功能。
面-肩-肱型肌营养不良（facioscapulohumeral muscular dystrophy，FSHD）是一类遗传因素与表观遗传因素相结合的疾病，分为FSHD1型和FSHD2型。正常人的4号染色体上有11~400个D4Z4重复单元，而FSHD1患者仅有1~10个D4Z4拷贝数。后来发现，DZ4Z区域包含DUX4基因，DZ4Z重复数减少将上调DUX4蛋白表达量。因此，目前认为D4Z4串连重复拷贝数减少与DUX4表达失调是导致FSHD1的两大遗传因素。而FSHD2则与SMCHD1基因突变所致的表观遗传学变化有关[40]。以FSHD1的治疗为例，研究人员通过AAV病毒在小鼠体内过表达DUX4，再用干扰RNA对DUX4进行敲减，与过表达DUX4组相比，敲减组小鼠的肌肉组织无明显肌萎缩现象，四肢抓力也明显改善[41]。另外，用2′OMePS修饰的ASO干预FSHD1患者成纤维细胞，使DUX4的mRNA表达量下降了50%[42]。
阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）和帕金森病是最常见的神经退行性疾病，大多AD和帕金森病患者呈散发分布，仍有部分AD和帕金森病呈遗传起病。遗传性AD的重要致病机制之一就是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因或早老素（presenilin）基因突变导致β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑内沉积[43]。帕金森病也有类似的毒性蛋白聚集现象，其中，常染色体显性遗传帕金森病的主要致病机制是由于α突触核蛋白（α-synuclein，SNCA）基因重复变异而产生了路易小体（Lewy body）聚集[44]。近年来，AD的基因治疗主要聚焦在如何降低Aβ蛋白，多个研究团队将基因治疗与免疫治疗相结合，开发AAV疫苗，筛选特异针对Aβ的抗体，通过主动或被动免疫，封闭Aβ[45]。另外，脑啡肽也是降低Aβ蛋白的明星分子，它被认为是一种Aβ蛋白酶，向AD小鼠心腔注射AAV介导的脑啡肽后，小鼠脑内Aβ水平降低，学习记忆能力也得到了提升[46]。除此之外，也有科学家用干扰RNA敲减Aβ生成途径中的关键酶，例如β-分泌酶（β-secretase），抑制APP蛋白的剪切，从而减少Aβ沉积[47]。对于帕金森病的基因治疗，从根本上就是降低SNCA表达量，因此，研究人员尝试应用RNA干扰沉默SNCA[48]以及过表达Parkin或Beclin-1，Parkin通过降低SNCA的表达而起到神经保护的作用，Beclin-1作为自噬通路的重要分子，能够促进SNCA以及APP等毒性蛋白的清除[49]。
六、总结与展望
在众多的基因治疗技术中，AAV介导的基因转导、基因敲减或敲除是最常见的干预方式，但由于干扰RNA敲减效率和特异性不高，难以应用于临床。另外，ASO药物的稳定性和特异性较高，部分ASO药物逐渐开始走上临床，但其给药方式困难、价格昂贵，在国内仍然难以普及。近年兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术逐渐展示出其优越性，无论对于神经遗传病动物模型的构建，还是基因缺陷的修复，都比传统的基因打靶策略更快速、更高效，但其脱靶现象仍没有完全克服。近期涌现出的单碱基编辑技术（base editing，BE），能够更为精确地编辑目标碱基，然而还只局限于胞嘧啶到胸腺嘧啶以及腺嘌呤到鸟嘌呤的编辑，即ABE和CBE系统，还未实现4种碱基之间的任意替换。
无论是AAV介导、ASO导入还是CRISPR/Cas9，都面临着给药方式和给药时间的选择。对于神经遗传病的治疗而言，成体治疗是关键。对于DMD和CMT，有效的局部给药不仅能消除主要症状，还能尽可能地降低毒性和不良反应；但对于亨廷顿病、SMA等累及多个部位的疾病而言，则要尽可能全身给药并使药物有效透过血脑屏障。神经遗传病的发病时间具有明显的临床异质性，若能根据不同的发病时间和程度，调整给药时间、给药剂量、给药频率，达到最适药物浓度，制订个体化治疗方案，将为患者带来更多福祉。
总体而言，基因治疗为越来越多的神经遗传病患者带来了曙光，但在我国尚需要更多的基础与临床试验促进其临床转化。目前神经遗传病主要以临床诊断、基因筛查、产前诊断为基础，结合新型药物治疗，配合康复锻炼，尽可能延缓疾病的进展。同时，我们也应结合我国的神经遗传病基因谱系特征，探索更适合中国人群的基因治疗策略和药物。
参考文献略
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