Nat. Chem. Biol. | 生长调节因子ppGpp调节蛋白的捕获和鉴定

来源：王初课题组

大家好，这周带来Nature Chemical Biology上的一篇文章，Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator，通讯作者是来麻省理工学院的Michael T. Laub，他的研究方向是微生物学和遗传学。

核苷酸序列ppGpp是细菌中一种高度保守的第二调节信使，它在调节细菌生长的过程中起着十分重要的作用，它可以调节DNA复制、转录、翻译和其它代谢过程，从而影响细菌细菌抵抗饥饿、压力。抗生素等。尽管它在调节细菌生存中起着十分重要的作用，近些年来也有许多研究它，但是由于它调节的效应蛋白并不为人所知，所以对于ppGpp究竟是如何调节细菌生长的，还是完全未知的。前人研究中发现了28个它的效应蛋白，其中绝大多数并未被阐释作用机理，只有RNA聚合酶（RNAP）被证明具有两个可以结合ppGpp的位点，从而抑制rRNA和核糖体蛋白基因的表达。但是本文作者研究发现，当突变掉ppGpp结合RNAP的两个位点后，仍然存在着ppGpp对细菌生长的抑制现象。说明除了RNAP，ppGpp还通过其它效应蛋白影响细菌生长。

为了捕获和鉴定到这些蛋白，作者设计并合成了ppGpp的探针，即通过肽段连接光交联基团双吖丙啶和生物素，结合SILAC技术，通过与细胞裂解液孵育并紫外照射进行交联，进而富集、蛋白酶切和质谱检测，找到ppGpp作用的效应蛋白。

作者三次重复共鉴定到了290个蛋白，选取ratio大于2.8为高显著性蛋白，共有56个。其中有许多控制关键细胞过程的酶，包括核苷酸合成所需的13种酶。已知的28个ppGpp结合蛋白中，作者鉴定到了20个都是ratio大于2.8，其余8个中有7在质谱中没有检测到,1个ratio小于2.8。作者选取了几个已知的蛋白和新鉴定到的蛋白，纯化后通过恒温滴定量热法ITC和酶活检测方法，证明确实与ppGpp结合，并且除了GpmA被激活50%以外，其余都是被抑制酶活，而PurF更是被抑制了75%以上的活性。

PurF是催化嘌呤的从头合成的酶，作者通过结构分析、生化实验和遗传分析，在PurF上设计了一种突变，使得能够消除ppgpp对它的调控，后续发现会导致ppgpp积累和嘌呤核苷酸合成通路的失调，证明了PurF是ppGpp调节细胞生长的重要效应蛋白。

总之，本文研究全面探索了ppGpp的效应蛋白，并且阐释了ppGpp对于细胞生长的调节机理。 可以为ppGpp调节作用的研究提供有效的信息，并且开发的ppGpp探针还应能在其他物种（包括病原体）中对ppgpp效应蛋白的鉴定。  

https://www.nature.com/articles/s41589-018-0183-4

DOI:10.1038/s41589-018-0183-4