在本文中，作者开发了一种基于酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)的正交有机相分离(OOPS)的方法，用以解决传统通过oligo(dT)不能用于细菌系统的问题。传统通过oligo(dT)纯化RNA，随后鉴定RNA结合蛋白RBPs的方法依赖于poly(A)尾巴，而且纯化需要大量原料，使其难以在动态条件下施展拳脚。作者开发的AGPC方法首先通过UV交联获得稳定的RNA-蛋白质复合物，使其保留在有机相和水相之间的相界面上，再使用蛋白酶K处理即可分别得到交联的RNA和蛋白质。
为了确定AGPC方法能否得到RNA交联的蛋白质，作者设计了SILAC标记实验进行验证。在最初的SILAC实验中作者在细胞培养液中添加了同位素标记的氨基酸，轻标组使用了UV光进行交联，重标组不做处理，轻重组混合后重复进行相分离以除去非交联蛋白，质谱鉴定即可得到交联蛋白。但这些交联蛋白中也包含例如糖蛋白等物理性质与RBPs相似的蛋白，仅通过UV交联不足以区分它们，所以作者设计了第二组SILAC实验，等量的轻重标组被相同的进行UV交联后，重标组使用RNase处理，轻标组则不作处理，通过质谱即可得到RNase敏感的蛋白质。结合RNase处理，作者认为即可得到靠谱的RBPs。
作者通过OPPS在U2OS、HEK293和MCF10A细胞鉴定到了总共1838种蛋白，与先前RBPs研究数据比较显示出了71%的重复。此外作者还比较了OPPS与非poly(A)依赖性的RICK和CARIC (由北京大学陈兴课题组开发)方法纯化的蛋白质，结果显示出了80%的overlap。这些结果证明了OOPS可以得到大部分已被证实的RBPome，包括不结合含有poly(A)尾巴RNA的蛋白质，具有很好的可靠性。
除了已知的RBPs，OOPS还可以鉴定到许多未知的潜在RBPs，在鉴定RBP及其结合位点上具有很大的应用潜力。
文章作者：LYP
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