DOI: 10.1038/s41590-018-0208-x (后台回复miR-155获取PDF版文献)
众所周知，基因表达的细胞类型特异性调节是发育生物学中的基础原理。基因表达的细胞类型特异性差异调控使具有不同功能的细胞能够对不同的内在和外在环境作出微妙反应。许多microRNA及其靶mRNA在不同细胞类型中共表达。然而，我们目前还不清楚miRNA对靶基因的调控是以独立还是依赖细胞环境的方式受调节的。
2018年9月17日美国Rudensky团队在Nature Immunology（IF=21.809）上发表了一篇以miR-155 miRNA为例来研究细胞环境对基因调控影响的文章。
下面我们从1）研究摘要2）课题设计 3）主要内容及结果三个部分介绍这篇文章，以帮助大家尽快了解细胞环境对基因调控的影响。
该研究试图在野生型和miR-155缺陷型小鼠的四种关键免疫细胞（活化的巨噬细胞，树突细胞，B细胞和T细胞）中，通过iCLIP定位miR-155靶标；RNA-seq进行mRNA定量，以评估miRNA降解mRNA的效果；并通过poly(A)-seq进行3’非翻译区（UTR）分析，以此鉴定miR-155差异结合的靶标。此研究表明尽管选择性ApA（多腺苷酸化）会影响不同miR-155与某些转录产物的结合，但是大多数情况下，相同的3’-UTR在同类型细胞中受到差异调节，这表明存在不依赖ApA以及依赖细胞环境miR-155介导的基因调控。
为了全面描述miR-155调控网络，作者使用单核苷酸分辨率CLIP（iCLIP）精确定位miR-155-靶位点，通过RNA-seq来测量抑制效率，并利用poly（A）-seq绘制和量化3’-UTR 剪切体。
实验材料为：野生型和miR-155缺陷型小鼠中提取的激活的B细胞、树突细胞、巨噬细胞和CD4 + T细胞。
具体实验流程如下：
技术介绍
iCLIP技术：它是单核苷酸分辨率的交联和免疫共沉淀反应，在基因表达的转录后调控领域常用于鉴定蛋白-RNA间是否存在互作。iCLIP是对CLIP技术的改进，它巧妙利用交联位置能够抑制逆转录的进行，并可以用蛋白酶K进行解交联的原理，大大提高了CLIP方法的分辨率，可以从核酸水平确定RNA-蛋白的结合位点。并且运用随机标签标记cDNA，避免了PCR扩增偏好性对高通量测序带来的影响。
3.1 miR-155靶标的iCLIP分析
在免疫激活24,48,72小时后测定四种细胞类型中miR-155丰度，作者发现，在四种细胞类型免疫激活后miR-155表达均显著增加（图1 a）。接下来作者使用抗Argonaute 2抗体从免疫活化48小时的细胞中免疫沉淀RISC结合的RNA（图1 b），并从分离的RNA中产生iCLIP文库，捕获两种microRNA及其mRNA靶序列。通过与初级microRNA序列中相应基因座比对的reads数估计成熟microRNA的表达丰度，结果证实miR-155是野生型和miR-155缺陷细胞之间唯一表达显著变化的microRNA（图1 c）。相同细胞类型和基因型的生物平行间间iCLIP库的重复性较好（Pearson相关系数0.7 - 0.9）（图1 d）。统计不同细胞类型的四个实验重复，iCLIP读数比例映射到不同基因组图库类别的比例（图1 e），在4种细胞类型的999个基因中发现了1200个靶标位点，包括796个（66.3％）3’UTR、386个（32.2％）编码序列（CDS）、18个(1.5%) 5’ UTRs。特别的，在成对比较中发现约20-75%的miR-155靶位点是细胞类型特异性的，由此表明miR-155具有显著的细胞环境依赖性调节。
图1 iCLIP文库概览
3.2 靶标和miR-155水平不能完全解释选择性调节
对于观察到的背景特异性的解释是，一些细胞类型特异性miR-155-靶基因可能尚未表达或可能在其他细胞类型中表达非常弱。实际上，当基因含有一种细胞类型特异的miR-155靶标时，该基因在这种细胞类型中的表达高于那些未显示差异iCLIP信号的其他细胞类型。而后，作者通过iCLIP分析发现miR-155具有显著的细胞环境依赖性调节。当作者限制细胞类型与共表达基因之间的比较时，731个共表达基因中的931个靶位点仍然存在，并且保留了大部分背景特异性（图2 b, c）。因此，单独mRNA的细胞类型特异性表达不能解释观察到的细胞背景特异性调控。
不同细胞类型中miR-155丰度的差异（图1a，基因组浏览器overlay展示，）也可以部分解释miR-155靶向的细胞环境特异性，最大数量的细胞类型特异性靶位点是在树突状细胞中发现，其中miR-155表达也最高（图2 b）。
在每种细胞类型中鉴定到的miR-155依赖性位点数量与相对miR-155表达一致（图1 c），表明一些背景特异性位点可能对miR-155的亲和力较弱，但是在较高miR-155量或其他细胞因子存在的情况下可以被调节。
当我们将miR-155靶标按其存在的细胞类型数量分类时，那些存在于更多细胞类型中的靶位点，仅具有6mer结合的位点所占比例显著低于那些存在于较少细胞类型中的靶位点（ Fisher精确检验P <2.57×10-10,），具有8mer结合的位点比例显著更高（fisher精确检验p><1.79×10-9；图2>GO富集的统计计算方式）。这与前人的研究一致，存在于三种或四种细胞类型中的位点，其miR-155-种子匹配序列也显示出比一种或两种细胞类型中存在的位点具有更高的进化保守性（图2 e; P<>GSEA中）。然而，许多细胞类型特异的靶标仍然存在于具有较低miR-155表达的细胞类型中，因此表明其他细胞因子或潜在的ApA（多腺苷酸化）可能在细胞类型特异性靶向中起作用。
图2 miR-155介导的Ago结合在四种免疫细胞类型中的不同结合位点
a) 显示跨越四种细胞类型的通用结合和差异结合的miR-155位点的实例。iCLIP，RNA-seq和poly（A）-seq文库的丰度显示为深色代表野生型（WT），浅色代表miR-155-敲除（KO）。含有miR-155-seed的iCLIP峰以灰色矩形突出显示; *表示WT和KO覆盖范围之间的显著差异（FDR<0.025）。b）根据四种细胞类型的结合特异性对位点进行分类，并且通过对相应基因的rna-seq fpkm值的层次聚类来确定每个类别内的顺序。每行代表mir-155="" 6mer种子匹配周围250="" bp，颜色表示log="" 2="" (wt/ko)的="" iclip="" 覆盖度,="">韦恩图的结果表明在每种细胞类型中鉴定的miR-155依赖性位点的数量与相对miR-155表达一致，表明一些背景特异性位点可能对miR-155具有较弱的亲和力，仅可以受到更高量的miR-155或其他细胞因子的调节。 d) 共表达基因中imR-155依赖性位点的种子类型组成。 e) 共表达基因中miR-155依赖性位点的PhastConst评分。
3.3 miR-155介导的调节是特定于细胞环境的
作者分析了通过差异iCLIP鉴定的miR-155依赖性靶标诱导的调节程度。使用野生型和miR-155缺陷细胞之间的mRNA表达变化来估计每个基因的miR-155调节程度。结果表明miR-155依赖性iCLIP位点在3’UTR中的显著性与相应基因的调节程度相关，但CDS位点未发现这种相关性。因此，为了进一步分析miR-155对基因调控的影响，作者仅考虑3’UTR中的miR-155靶标。
在四种免疫细胞类型中，作者首先检查了根据不同3’UTR种子区结合模式所定义的潜在靶基因中mRNA表达变化的分布。结果显示，3’UTR中具有miR-155依赖性iCLIP位点的基因显示出比具有根据种子序列匹配预测的靶标有更强的抑制（图3）。
作者还将iCLIP定义的靶基因与通过TargetScan 7.0预测得到的高可信度等数目的基因进行了比较。尽管两组基因中分布于前10％左右的调节程度相似，但iCLIP定义的靶基因整体显示出比TargetScan预测的靶基因更强的调节（图3）。因此，通过差异iCLIP测定的miR-155介导的不同细胞环境的基因调控比基于细胞类型不可知序列的预测更准确。
图3 miR-155抑制四种免疫细胞类型的不同基因集
在树突细胞（a）、B细胞（b）、CD4+T细胞（c）和巨噬细胞（d）中，用不同基因集合的累积分布函数（CDF）显示miR-155-KO和WT细胞之间RNA-seq表达变化的分布。基因集合包括所有表达的基因，具有3’-UTR miR-155 6mer/7mer-A1-m8/8mer-种子匹配的基因和具有6mer种子匹配的3’-UTR miR-155依赖性iCLIP位点的基因（FDR<>
为了进一步阐明miR-155调节的细胞环境特异性，作者对四种免疫细胞类型进行成对比较，以评估常见细胞类型特异性miR-155靶标的调节程度。在每种免疫细胞类型中，通过差异iCLIP鉴定的miR-155-靶基因表现出比对其他细胞类型特异性抑制更强的抑制作用。总体而言，细胞类型特异性靶基因显示出比普通靶基因更不明显的调节（图4）。
图4 背景特异性miR-155靶向导致了细胞类型间基因调控的差异
四种免疫细胞的六个成对比较，描绘了含有共同（实线）和细胞类型特异性（虚线）3’-UTR miR-155依赖性iCLIP位点的基因去阻遏，以CDF值显示。以具有3’-UTR miR-155-种子匹配的基因为参考。每个成对比较中仅包括共表达的基因（WT RNA-seq FPKM>1且差异<>
为了验证细胞类型依赖性miR-155基因抑制，作者对几种细胞背景依赖性基因靶点进行荧光素酶报告基因检测，展示了Hif1a和Jarid2（优先在B细胞中被抑制）， Actr10和Terf1（B细胞特异性靶标），以及Tbca, Uqcrfs1和Zfp277（树突细胞特异性靶标）的结果（图5， P<0.05;>P<0.01）。fold>
图5 细胞类型依赖性miR-155介导抑制的验证
这些结果与作者支持的miR-155细胞类型特异性调节的分析结果一致。作者还通过证明各细胞类型中Aicda，Inpp5d，Spi1和Tab2蛋白表达降低进一步证实了miR-155介导的调节。此外，还在蛋白质水平观察到Jarid2和Hif1a的B细胞特异性抑制和Uqcrfs1的树突细胞特异性抑制。这些结果为作者对miR-155介导的基因表达调控的基因组数据分析提供了额外的证据（图6）。
图6 miR-155靶蛋白水平定量研究
3.4 竞争性内源RNA不会影响miR-155靶向
“竞争性内源RNA”假说提出具有共同miRNA-靶位点的转录物竞争调节，从而可能解释一些长链非编码RNA的生物学功能。某些长链非编码RNA和环状RNA含有大量的miRNA-靶位点，并且可能作为miRNA’海绵’起作用。因此，差异表达的miR-155海绵可能有助于细胞背景依赖性miR-155介导的较弱靶标的调节。然而，当作者检测mRNA中的miR-155靶位点以及内含子区域内的位点和注释非编码RNA时发现大多数编码和非编码RNA仅包含一个或两个miR-155靶位点。因为环状RNA通常通过连续外显子的反向剪接形成，所以作者没有鉴定出在这四种免疫细胞类型中似乎可能充当miR-155的环状RNA海绵候选物。
作者试估计每种细胞类型中给定转录物结合的miR-155-Ago复合物的比例。假设通过iCLI计数的miR-155-Ago是合理的，并且估计每种细胞中转录物将结合大约3-10%的转录物结合复合物（图7 b）。结果显示即使是在这四种密切相关的免疫细胞中，每种细胞类型结合最多的靶标也不同。主要的miR-155靶基因包括在树突细胞中编码抑制性受体配体PD-L1以及巨噬细胞编码清道夫受体1的Msr1。因此，分析显示并没有表明竞争性RNA充当miR-155调节剂。
图7 差异iCLIP鉴定miR-155依赖性位点
3.5 ApA对细胞类型特异性miR-155靶向的贡献有限
以往的研究表明，具有多个3’-UTRs的基因在激活的免疫细胞（特别是T淋巴细胞）中增加了短同源异构体的使用，同时也会增加miR-155的表达，这被认为是逃避miRNA介导的调控的一种潜在机制。因此，通过miR-155观察到的基因表达的细胞类型依赖性调空的另一个可能解释是选择性多腺苷酸化（ApA）。在体外用抗CD3和抗CD28抗体刺激CD4+T细胞24小时和48小时后，对CD4 + T细胞及其激活的CD4 + T细胞进行poly（A）-seq分析（图8 a）。尽管差异分析确实揭示了3’-UTR-同源异构体的使用在24小时和48小时中都有广泛变化，但在激活细胞中短同源异构体有显著改变，同时在大量转录本中也观察到激活细胞中长同源异构体的使用也显著增加（约40%的差异使用）。[c2] [d3] [e4] 对miR-155靶向的双同源异构体3’UTR集中分析结果未显示在长同源异构体中含有miR-155结合位点的mRNA选择性缩短（图8 c）。因此，3’-UTR长度的变化似乎不会显著减弱T细胞活化后miR-155介导的靶向。
图8 Poly(A)-seq捕捉CD4+ T细胞活化过程中3’-UTR同源异构体使用的变化
a) 在CD4+T细胞活化期间，可变剪接体使用中具有显著（FDR<5%）变化的两个3’-utr实例。轨迹表示激活后0小时、24小时和48小时归一化poly(a）-seq读长覆盖率。 b)="" 在cd4+=""><5%）变化。 c)="">
为了研究选择性多聚腺苷酸化是否可能有助于细胞类型特异性靶向，作者在四种免疫细胞类型中进行了poly(A)-seq。对于单3’UTR基因，poly(A）-seq FPKM与RNA-seq FPKM具有相关性，表明poly(A）-seq能够定量3’-UTR-同源异构体的表达。四种细胞类型的差异分析显示3,460个共表达的多UTR基因中有2,703个在一定程度上显示出选择性多腺苷酸化（图9 a）。
与其他基因相比，miR-155靶标在差异使用的多UTR基因中显著富集（图9 b）。因为poly(A)-seq文库是针对野生型和miR-155缺陷细胞生成的，因此作者评估了3’-UTR 差异选择中miR-155调节。 与先前观察结果一致，给定miR-155-靶位点对3’-UTR异构体的调节同该异构体与3’-UTR末端的距离成负相关，因此表明ApA可能是细胞环境特异的miR-155调控机制之一。
在多3’-UTR剪接体中，观察到基因水平miR-155调控范围会随着单个细胞类型中miR-155-靶位点的ApA同源异构体的大量使用而增加。作者还通过细胞类型之间的成对比较观察到ApA和背景特异性miR-155结合的共同发生的实例（图9 c）。然而，在大多数情况下，细胞类型之间亚型使用的变化小于10％，而miR-155和靶mRNA的总体表达变化具有更大的动态范围。因此，大多数观察到的背景特异性靶向不能归因于选择性多腺苷酸化（图9 c）。
图9 选择性多腺苷酸化在miR-155调控细胞内基因表达中的作用
a)多3’-UTR同源异构体在四种细胞类型的热图变化。b)3’-UTR包含miR-155细胞类型特异的ApA目标和显著差异。 c) iCLIP、RNA-seq和Poly(A)-seq在Rbm33的树突状细胞和CD4+T细胞中的读数覆盖。 d) Venn图显示了树突状细胞和B细胞中共同的细胞特异性miR-155靶基因数量，这些基因在去除具有细胞类型特异性ApA差异基因之前和之后的变化。
作者还指出，Ago iCLIP数据集可用于表征其他miRNA的靶标（图10）。
图10其他miRNA的iCLIP靶位点表达诱导显著的基因抑制
具有miR-142a KO的B细胞(a)和树突状细胞(b)以及具有miR-27a过表达(c)的CD4+T细胞中的mRNA表达变化，显示为不同基因组的CDF。
此研究证明了miR-155在四种细胞中对基因表达的细胞背景依赖性调节，并提供了这些关键免疫细胞类型中miR-155调节网络的完整图谱。此外，这些细胞中RISC结合的全基因组分析能够全面鉴定其他miRNA的靶标，因此为阐明免疫系统中miRNA介导的基因调控提供了宝贵的资源。
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