骨质破坏是包括骨质疏松症和炎症性关节炎在内的多种骨骼疾病的主要特征和严重后果，并显着降低这些患者的生活质量并增加其残疾风险。破骨细胞是唯一专门的骨再吸收细胞，它作为骨质破坏相关疾病（如类风湿性关节炎（RA）和绝经后骨质疏松症）的独特致病因子起着不可或缺的作用。本文作者前期在对参与破骨细胞生成的小RNA的初步研究表明，在肿瘤坏死因子（TNF）诱导的炎症性破骨细胞分化中，MIR-182是一种新的调节因子。有文献表明miR-182在细胞生长、细胞命运决定、癌症和T淋巴细胞扩增中的重要作用。 本研究中，作者发现miR-182为在生理和疾病条件下破骨细胞生成的关键的正调节因子，并提供由miR-182-PKR-IFN-β轴驱动的破骨细胞生成调节的新机制。 靶向miR-182及其下游靶标可能代表着十分有吸引力的预防病理性骨破坏的替代或补充治疗方法。
1. miR-182调节破骨细胞生成和骨稳态
作者首先使用小鼠骨髓衍生的巨噬细胞（BMM）作为主要破骨细胞前体检查了破骨细胞生成过程中miR-182的表达水平。RANKL作为主要的破骨细胞生成诱导剂时，miR-182表达在破骨细胞分化的时间过程中增加（Fig 1a）。紧接着作者构建了miR-182破骨细胞条件基因敲除鼠（Mir182ΔM/ΔM），以及miR-182破骨细胞条件基因敲入鼠（Mir182MTG），分别与其同窝野生型小鼠（WT）作对照进行研究。结果显示与WT小鼠培养的细胞相比，Mir182ΔM/ΔM 小鼠培养的细胞由于miR-182缺乏，显著抑制由RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成（Fig 1b）。相对于WT组小鼠的对照细胞，抑制TRAP阳性多核的产生同时，关键的破骨细胞生成转录因子Nfatc1（编码NFATc1）和Prdm1（编码Blimp1）以及破骨细胞标记基因Acp5（编码TRAP），Ctsk（编码组织蛋白酶K）和Itgb3的表达（编码β3整联蛋白）在RANKL处理的Mir182ΔM/ΔM小鼠细胞中显著降低（Fig 1c）。接着作者在使用RANKL诱导人CD14阳性外周血单核细胞（PBMC）衍生的破骨细胞前体向破骨细胞生成的过程中，也发现miR-182表达在破骨细胞分化的时间过程中增加（Fig 1d）。与WT组培养的细胞相比，Mir182抑制剂作用的细胞由于miR-182缺乏，显着抑制由RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成（Fig 1e）。相对于WT组的对照细胞，抑制TRAP阳性多核的产生同时，关键的破骨细胞生成转录因子和NFATC1，PRDM1，CALCR（编码降钙素受体）和ITGB3的破骨细胞基因表达在RANKL刺激的Mir182抑制剂处理组细胞中显着降低（Fig 1f）。
微量计算机断层扫描（μCT）分析显示与WT同窝对照小鼠相比，Mir182ΔM/ΔM小鼠骨量显着增加、表现出强烈的骨折表型（Fig 1g）。与WT同窝对照小鼠相比，Mir182ΔM/ΔM小鼠骨小梁体积、骨矿物质密度（BMD），连接密度（Conn-Dens）、骨小梁数量均增加，骨小梁间距减小（Fig 1h）。此外，miR-182影响体内破骨细胞的形成。与WT对照组相比，Mir182ΔM/ΔM小鼠中观察到的破骨细胞数量较少和破骨细胞表面积较小（Fig 1 i, j）。
总之，以上数据表明miR182是一种关键的破骨细胞生成调节因子并在维持骨骼稳态方面起着重要作用。
2. miR-182在病理性骨病（骨质疏松和关节炎）中的作用
通过构建OVX模诱导的骨质疏松症模型，发现Mir182ΔM/ΔM小鼠的骨量是没有减少的。并且这种保护不是由于Mir182ΔM/ΔM小鼠的基础骨量高于WT小鼠，而是因为miR-182的缺乏抵消了Mir182ΔM/ΔM小鼠中OVX诱导的骨丢失（Fig 2a-c）。骨组织形态学分析进一步显示WT 小鼠中OVX组中的破骨细胞数量和表面明显大于假手术组。 相比之下，Mir182ΔM/ΔM小鼠中OV组X与假手术组相比也未能刺激病理性破骨细胞生成，包括破骨细胞参数（破骨细胞数和表面积）在Mir182ΔM/ΔM小鼠的假手术和OVX之间也保持相当（Fig 2d-e）。
为了在体内进一步检验这一假设，作者先使用由TNF-α或脂多糖（LPS）诱导来构建成熟的炎症性颅骨骨溶解小鼠模型。给颅骨骨膜施用TNF-α构建构建成熟的炎症性颅骨骨溶解小鼠模型后，Mir182MTG小鼠与WT组相比，通过对颅骨表面形成的吸收性凹坑的μCT分析可以确定miR-182增加导致显着增强的糜烂，颅骨组织切片中显示的破骨细胞形成显着增加（Fig 2f-i）。给颅骨骨膜施用LPS构建成熟的炎症性颅骨骨溶解小鼠模型后，Mir182ΔM/ΔM小鼠与WT组相比，通过对颅骨表面形成的吸收性凹坑的μCT分析可以确定miR-182确实抵消了LPS导致的广泛骨破坏，抵消了颅骨组织切片中显示的破骨细胞形成（Fig 2j-m）。
探究了小鼠病理模型之后，作者还测试了miR-182在K/BxN血清诱导的炎症性关节周围骨质侵蚀关节炎模型中的作用。Mir182ΔM/ΔM小鼠与WT对照小鼠相比中miR-182的衰减显着抑制了对关节周围骨质侵蚀，破骨细胞数量和吸收部位表面的的增加 。除了Mir182ΔM/ΔM小鼠的骨侵蚀外，关节肿胀所表明的炎症性关节炎的临床过程在10天疗程期间没有减少（补充图7），表明miR-182在该模型中没有显着影响炎症。但显着影响破骨细胞的形成和骨质侵蚀（Fig 2n, o）。
以上三种炎症模型共同验证了miR缺失在病理性骨丢失中起着至关重要的作用，抵消病理性骨病的骨丢失。
3. 抑制miR-182对骨质丢失的治疗效果
已有研究证明，壳聚糖（CH）已被广泛用作小核苷酸寡核苷酸的药物递送载体。最近使用CH-纳米粒子有效地在体内递送小miRNA以成功靶向破骨细胞的工作提示作者使用相同的优化包装装配方，其中小RNA寡核苷酸在骨髓中具有最高的生物分布并且有效地靶向破骨细胞谱系。
作者首先构建了OVX模诱导的骨质疏松症模型，通过μCT分析显示骨质参数BV/TV，BMD，Tb.N，Tb.Th和Tb.Sp评估，在手术后5周分别注射含有相应对照RNA寡核苷酸的CH-纳米颗粒和含有miR-182的CH-纳米颗粒。结果表明含有miR-182抑制剂的CH-纳米颗粒极大地抑制了OVX诱导的过度破骨细胞形成。说明miR-182抑制剂在OVX模型中的作用与miR-182小鼠体内缺失在OVX模型中的作用一致（Fig 3a-e）。
同时，作者也验证了miR-182抑制剂的CH-纳米颗粒在炎症模型中的作用，与含有对照RNA寡核苷酸的CH-纳米颗粒相比，从炎症性关节炎早期开始用含有miR-182抑制剂寡核苷酸的CH-纳米颗粒处理小鼠，显着抑制了破骨细胞形成，表明破骨细胞数量减少了近70％。破骨细胞表面积减少64％，结果有效减轻约67％的炎性关节炎骨吸收（Fig 3f,g）。
4. miR-182通过靶向PKR抑制自分泌IFN-β途径
下一步，作者研究miR-182作为破骨细胞生成调节剂起作用的机制。首先分别对WT对照和Mir182ΔM/ΔM小鼠的基线破骨细胞前体和RANKL刺激后的破骨细胞RNAs（RNA-seq）做了高通量测序来进行基因表达延伸，以鉴定在破骨细胞生成期间由miR-182调节的基因。结果表明miR-182的缺乏显着抑制破骨细胞生成调节因子（例如NFATc1和Prdm1）和破骨细胞标记基因（例如TRAP，组织蛋白酶K，OCSTAMP、DCSTAMP和Atp6v0d2）的表达。GO分析和GSEA分析提示IFN途径与miR-182缺失的关系。作者又查阅了先前的文献证明干扰素途径（IFNα，β或γ）抑制破骨细胞分化。 RANKL在破骨细胞中诱导的内源性IFN-β是维持平衡分化状态的重要抑制反馈环。因此，作者认为Mir182ΔM/ΔM细胞中I型IFN应答基因组的高度显着富集反映了显着增强的IFN途径，并且可以通过这个来解释miR-182缺失抑制的破骨细胞生成的表型（Fig4a-d）。
根据背景知识的介绍可知，miR-182不太可能直接靶向所有这些基因，因为它们中的大多数不含有miR-182种子区域。 因此作者假设miR-182直接靶向某些基因，这些基因在破骨细胞生成过程中反过来特异性地调节IFN应答基因。 因此，作者分别对WT和miR-182功能丧失(Mir182ΔM/ΔM)的骨髓衍生的巨噬细胞、WT和miR-182功能获得（Mir182MTG）的骨髓衍生的巨噬细胞进行RNA-seq实验。获得了包含miR-182潜在靶标的24个基因列表。 然后，作者将这些基因与已发表的数据库重叠，该数据库通过实验验证了miR-182的1069个靶点，最终确定了4个miR-182直接靶点（PKR、ELOVL6、GPATCH2、JAZF1）。在这组基因中，编码双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的基因Eif2ak2以最高表达水平脱颖而出，而其他三个基因仅略微表达。重要的是，在这四种基因中，只有PKR是在I型IFN途径中起关键作用的充分表征的因子，这也是作者的假设，即miR-182靶向PKR，进一步调节下游IFN通路（Fig4e）。
为了验证编码双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的基因Eif2ak2是miR-182靶标的这一假设，作者进一步证实了Eif2ak2的3'UTR中miR-182的种子区域。此外，作者进行了3'UTR荧光素酶报告基因检测，发现miR-182模拟物下调报告基因Eif2ak2在3'UTR的荧光素酶活性。 Eif2ak2的3'UTR中miR-182种子区的突变消除了miR-182对Eif2ak2的3'UTR的调节作用（Fig4f-i）。
了解到PKR直接被miR-182靶向之后，作者检测了PKR在破骨细胞分化中的作用是否如假设的一般通过IFN途径发挥作用。作者利用从PKR敲除（Pkr−/−）和WT对照组（Pkr+/+）中分离的BMM作为作为三种破骨细胞培养系统中的破骨细胞前体，由单独的RANKL，RANKL或TNF引发激活这些破骨细胞前体。发现PKR敲除之后破骨细胞数量显著增加。在所有条件下，通过增强的破骨细胞生成、破骨细胞生成转录因子（如NFATc1和Blimp1）的基因表达升高、以及破骨细胞标记物，如Ctsk和Dcstamp的增高来评估PKR缺陷显着增加破骨细胞分化。这些结果表明PKR是破骨细胞生成的新型抑制剂（Fig5a-c）。由于PKR参与I型IFN途径，尤其是作为IFN-β表达的激活剂，作者检测了IFN-β的表达，发现PKR缺陷几乎完全阻断了RANKL对IFN-β的诱导（Fig5d,e）。而阻断内源性IFN-β增强了RANKL诱导的WT细胞培养物中的破骨细胞生成（Fig5f）。最后，作者敲除了Mir182Δm/ΔMBMM中的PKR，并发现敲除后Mir182Δm/ΔM BMMs中抑制的破骨细胞分化显着逆转至与WT细胞相似的水平（Fig5g）。
随后，作者检测了IFN-β是否是miR-182的关键下游效应物。结果发现miR-182的表达显着增强了RANKL诱导的IFN-β水平，Mir182ΔM/ΔM小鼠血清中IFN-β的蛋白水平也显着增加，此外，使用IFN-β中和抗体阻断内源性IFN-β或通过敲低IFN-β的表达，消除了miR-182缺乏对RANKL诱导的破骨细胞生成的抑制作用。而内源性IFN-β的中和对Mir182MTG细胞培养物中miR-182过表达增强的破骨细胞生成没有额外影响（Fig6a-d）。这些结果表明IFN-β是破骨细胞生成过程中miR-182的关键下游组分。
总的来说，本研究确定了一个新的调控机制，即miR-182直接靶向PKR，PKR下调反过来抑制由RANKL诱导的内源性IFN-β表达，从而调低反馈抑制环并激活破骨细胞生成。这种新鉴定的miR-182-PKR-IFN-β途径在破骨细胞分化和破骨细胞生成基因表达程序中起重要作用。
5. miR-182-PKR-IFN-β轴与RA的关系
作者研究了从健康供体和RA患者分离的人破骨细胞前体CD14（+）PBMC中miR-182的表达水平。 结果表明， miR-182水平在RA患者中急剧升高（Fig7a）。用TNF-α刺激人CD14（+）PBMC发现TNF-α诱导miR -182表达（Fig7b），在用能特异性阻断TNF活性的人源化抗体（Enbrel）对RA患者进行阻断疗法的一个月和两个月后，在CD14（+）PBMC中观察到显着降低的miR-182表达水平。同时，TNFi显着降低RA PBMC的破骨细胞生成（Fig7c）。此外，TNFi治疗后TNF活性的治疗性降低抑制了miR-182表达以及破骨细胞生成存在在每个RA患者（Fig7d）。进一步的统计分析显示RA PBMC中miR-182表达水平与破骨细胞生成之间存在强相关性（Fig7e）。TNFi治疗提高了RA PBMC中PKR和IFN-β的表达水平。 在TNFi处理后从每个RA患者分离的单核细胞中也测定到了这两个基因的显着升高。PBMC的破骨细胞水平与PKR和IFN-β的表达水平呈显着负相关（Fig7g-i）。
这些结果清楚地表明miR-182-PKR-IFN-β轴的调节模式在RA PBMC中是明显存在的。miR-182的上调、伴随的PKR和IFN-β的下调，与RA中的破骨细胞生成水平强烈相关。 miR-182-PKR-IFN-β轴与RA PBMC的破骨生成潜能之间的显着相关性提供了一些支持miR-182在人类中的破骨细胞形成功能的证据。 与从动物模型中获得的概念验证治疗优势一起使用，这些人类数据突出了靶向miR182抑制人类疾病中过度破骨细胞生成和骨侵蚀的有前景的治疗意义。
通讯作者：威尔·康奈尔医学院Baohong Zhao，全文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-018-06446-0
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