经过上次的视频，我们对单细胞测序有了基础的了解，这节课我们来学习一下单细胞测序的研究思路，以及如何将单细胞测序融入自己的研究之中。
一起来看视频
单细胞测序全搞定-2
单细胞测序应用案例解析
要想将单细胞测序融入自己的研究之中，首先要了解别人的单细胞测序相关研究是怎么做的。
▲图片来源于本期视频
综上可以发现，这些研究案例其实说的就是我们在上周的课程中讲的“单细胞研究的核心是划分细胞群体以及检测细胞群体间的差异表达基因”。
对上述案例进行总结，可以发现文章的逻辑论证关系均是“提出问题——单细胞测序——数据分析——结论验证——对结论进行深入探索”。
接下来通过一篇文献来进行详细讲解：
期刊名称：Nature Communications
影响因子：12.353
样本类型：乳腺上皮细胞
提出问题，确定研究方向
乳腺癌起因于乳腺上皮细胞发生基因改变，导致随后的组织稳态丧失。
乳腺癌上皮细胞由两种已知的细胞类型组成，分别是内层分泌腔细胞和外层基底/肌上皮细胞。最近的一系列报道表明，在小鼠的这两个细胞层中存在进一步的异质性。
此外，通过KIT的高表达鉴定了腔内祖细胞亚群，且已经使用流式细胞仪（FACS）分离策略鉴定了成熟腔细胞亚群。但还有待确定乳腺上皮细胞中是否存在其他不同的细胞以及这些细胞类型如何与已知的乳腺癌亚型相关。
下一代测序和微流体处理细胞与试剂的进步是我们有机会探索单个细胞水平上的细胞异质性，并使用单细胞的mRNA测序（scRNAseq）重建谱系层次结构。由于该方法利用单个细胞建立转录谱，所以可以对细胞群内的异质性进行无偏分析。
本研究的目标是使用无偏的scRNAseq在人乳腺上皮细胞内进行细胞类型和状态的分子普查。
单细胞测序及数据分析
scRNAseq揭示了乳腺上皮细胞中的三种细胞类型
作者利用Fluidigm C1对来自3个不同乳腺增生病人的868个细胞进行scRNAseq，质量过滤后，对其中的703个细胞的4500个基因进行分析，确定了三个主要的细胞群，即：basal cells（B）、Luminal1 (L1)、Luminal2 (L2)。
▲图1
微滴介导的scRNAseq揭示了亚群的多样性
为了确定是够存在额外的细胞多样性，作者接下来选择了更具扩展性的微滴介导的单细胞RNAseq平台（10x Genomics Chromium）。作者对来自四个个体（Ind4-7）的总共24,646个细胞进行测序，平均每个细胞约60,000 reads。
在质量控制过滤之后，使用Seurat对第一个体（Ind4）的详细聚类分析证实存在三种主要的上皮细胞类型，即Basal(KRT14+)、Luminal1 (L1；KRT18+/SLPI+)和Luminal2 (L2；KRT18 + / ANKRD30A +)，另外还有三种额外的小clusters：cluster8、cluster9、cluster10。且在每个主要上皮细胞类型中出现了多个亚群：Basal细胞中检测到三种不同的细胞状态； L1型细胞中观察到三种不同的细胞状态；L2型细胞具有两种不同的细胞状态。
▲图2
为了确定可在个体中推广的细胞状态，作者开发了一种比较方法：使用Ind4 中检测到的11个簇中的marker gene，进行成对基因评分分析，结果表明所有个体的主要细胞类型（Basal、L1、L2）都很容易匹配，且所有四个个体中的L1中都存在两种不同的细胞状态（L1.1和L1.2）。为了确认这一点，作者对来自四个个体的组合基底细胞进行了单独的Seurat分析。综合结果，作者能够将所有个体特异性聚类包含在最终聚类名称之中，即basal（B）、Myoepithelial（Myo）、Luminal1.1（L1.1）、Luminal1.2（L1.2）、Luminal2（L2）和小的未分类（X） 。
▲图3
验证结论
作者接下来使用间接免疫荧光分析来验证他们在蛋白质水平上的scRNAseq发现，并将新发现的细胞类型和状态空间整合到乳房的解剖结构中。ZEB1和TCF4的免疫染色结果表明以ZEB1和TCF4表达为特征的细胞状态存在与完整乳房组织的基底室内；KRT14 的免疫荧光分析证实了前面差异表达分析的结果：KRT14主要在基底细胞中表达。
▲图4
scRNAseq分析显示管腔室包含两个不连续的上皮细胞类型（L1，L2）。作者使用L1（SLPI）和L2（ANKRD30A）的特异性标记物使用原位免疫荧光鉴定它们在乳房组织中的空间分布，结果表明L1和L2在导管和小叶内彼此相邻。接下来作者确定了它们的激素信号状态，并用单细胞western印迹鉴定了三种细胞状态（ KRT8-negative, -low, and -high）。
这些分析证实了scRNAseq中观察到的模式与完整组织中蛋白质水平之间的显著一致性。基于细胞的基因表达信息，作者推测L1可能具有分泌功能，L2可能是乳腺上皮的激素响应单位。
▲图5
深入研究
为了理解这些观察到的细胞类型和状态是如何相互关联的，作者通过使用Monocle通过单细胞伪时间排序重建分化轨迹，结果表明系统通过一个连续的而非断开的谱系来维持。
▲图6
综上，作者运用10x Genomics单细胞转录组技术研究乳腺上皮细胞的细胞亚群，确定了3中新的细胞亚群（Basal、L1、L2），5种细胞状态（B、MYO、L1.1、L1.2、L2），经鉴定得到各亚群的marker基因（KRT14、KRT8、KRT18），更进一步结合单细胞测序实验的数据分析重建了分化轨迹。
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