cDNA文库
cDNA文库指的是某生物某一发育时期所转录的全部mRNA反转录形成的cDNA克隆集合。cDNA文库与基因组文库不同,基因组文库包含了cDNA文库,还包含了非转录的基因组序列,比如重复序列等。cDNA文库包含了细胞的全部mRNA信息,利于研究基因时空特异性表达、基因调控、基因功能等。cDNA文库可用于microarray或者高通量测序应用。
均一化cDNA文库
mRNA丰度指的是某种特定mRNA在总mRNA中所占的比例。据此, mRNA按其含量分为高丰度、中等丰度和低丰度。
高丰度mRNA:5000多个拷贝,占总mRNA的22%
中等丰度mRNA:200-300个拷贝,占总mRNA的49%
低丰度mRNA:1-15个拷贝,占总mRNA的29%。
这种基因表达上的差异为研究增添了困难。高拷贝基因给基因筛选和鉴定带来了不必要的浪费,尤其是进行大规模EST测序的时候。我们可以通过一定的策略,将cDNA文库进行处理,降低高丰度和中等丰度基因的比例,使得高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致,这种cDNA文库被称为均一化cDNA文库。均一化cDNA文库有利用充分研究基因的表达和对基因进行分析。目前主要有两种策略构建均一化cDNA文库。高丰度cDNA的复性速度快,而低丰度cDNA复性时间较长。因此,可以通过复性时间来降低基因频率差异。第二种策略是基于基因组DNA的拷贝数相对均一化的性质。即可以通过cDNA和DNA饱和杂交降低高丰度cDNA的丰度。
cDNA文库流程
cDNA文库构建流程主要如下图所示,包括总RNA提取、mRNA分离、反转录合成cDNA第一链、PCR扩增合成双链cDNA、cDNA片断分离、克隆重组反应。
01
构建cDNA文库,最好选取目的基因表达量最高的发育时期或者这一时期的特殊组织。将组织用生理盐水冲洗干净,剪碎,在液氮环境下充分研磨,加入Invitrogen公司的Trizol提取液,按照说明书流程提取总RNA。RNA浓度可以通过分光光度计测量,RNA质量可以通过1%琼脂糖-甲醛凝胶电泳检测。如果是真核样品,完整的总RNA具有清晰的28S和18SrRNA条带,并且28S条带的强度是18S的2倍。
完整的RNA(右)与降解的RNA(中)对比。
02
可以用Invitrogen公司的FastTrack mRNA isolation Kit对符合要求的总RNA进行mRNA的分离,具体步骤请看说明书。然后用1%琼脂凝胶电泳检测mRNA质量,用紫外分光光度计测定浓度。
03
mRNA纯化和质检后,还需要经过几个步骤构建cDNA文库,包括反转录合成cDNA第一链、PCR合成cDNA第二链、cDNA片断分离和克隆构建。可以利用下图流程或者直接使用Invitrogen公司的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。
cDNA文库构建流程示意图(Figueiredo et al. 2007)。
mRNA反转录成cDNA的过程被称为反转录。在mRNA 中加入Biotin-aatB2-Oligo(dT) primer和 SuperScript Ⅲ RT 酶进行反转录。
以cDNA第一条链为模板,加入大肠杆菌DNA Ligase、大肠杆菌DNA Polymerase I、大肠杆菌RNase H以及T4聚合酶合成cDNA第二链。
合成双链cDNA后,加入adapter buffer、attB1 adapter、DTT,16℃孵育16-24小时,目的是在链末端连接上attB1序列。然后进行片段分离,利用的是cDNA size fraction columns,收集500-4000bp之间的双链cDNA。
将收集到的双链cDNA与pDONR222质粒混合,通过BP重组反应链接载体。重组产物再通过转化导入感受态细胞中,摇菌培养(37℃,220r/min,1h)获得cDNA文库。
04
取细菌原液10ul,分别稀释10、100和1000倍,各取50ul涂板,37℃过夜孵育。
文库滴度(CFU/ml)=单菌落数*稀释倍数/涂布菌液体积
原始库容量(CFU)=文库滴度*文库体积(ml)
随机挑取单克隆,以M13F-M13R为引物,PCR检测插入片段大小,并估算文库重组率。
cDNA文库9折起
安必奇采用SMART cDNA文库构建方法,将mRNA在体外反转录成cDNA,与适当质粒载体连接后转化受体菌,进行繁殖扩增。最终获得包含组织或细胞全部mRNA信息的cDNA克隆群体。到目前为止,安必奇已经具有众多SMART cDNA文库构建的成功案例,能够构建各种材料来源的cDNA文库。我们一流的技术平台和经验丰富的专家会为您提供快速可靠的cDNA文库构建服务,并提供全面的检测报告,包括库容量、插入片段平均长度、重组效率及cDNA完整性等评价。
1,我们的优势
样本用量少- 一个样本文库的构建只需要1 μg总RNA。
全长比率高- 采用SMART cDNA文库构建专利技术,全长比率在30%以上。
库容量大- 我们的专家能够为您提供文库质量标准为 ≥1.0×106的高质量服务。
经验丰富- 安必奇经验丰富、专业精湛的专家团队为您提供最佳可靠的实验方案。
2,实验材料要求
若样品是动物组织材料,样品质量需大于5g。
若样品是植物标本,样品质量需大于20g。
若样品是培养细胞,请您提供5×107以上培养好的细胞。
若样品是Total RNA,要保证RNA没有降解,需要通过电泳等方法进行判断,其纯度要求A260/A280≥1.8,样品总量需大于500ug。
参考文献:
Figueiredo A , Aladje Baldé, Hélia Cardoso, et al. Cost effective method for construction of high quality cDNA libraries[J]. Biomolecular Engineering, 2007, 24(4):419-421.
杨少丽, 秦松. Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析[J]. 生命科学研究, 2018(5).
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