导读
二甲双胍因其独特的降糖效果和安全性，已成为Ⅱ型糖尿病患者的一线治疗药物。研究发现，二甲双胍可通过直接作用于肝细胞，调节线粒体复合体I活性、AMPK活性和AMP浓度，从而降低糖异生过程。同时，二甲双胍还可以通过抑制3-磷酸甘油脱氢酶的活性，导致肝细胞氧化还原状态改变，使肝细胞糖异生速度下降。然而，口服二甲双胍主要在小肠中吸收，血清中含量较低，因此肠道微生物在糖尿病的治疗中发挥着重要作用。
文章采用宏基因组测序和代谢组学分析手段研究肠道微生物对二甲双胍临床疗效的影响，结果表明，可以通过脆弱拟杆菌-GUDCA-FXR轴介导二甲双胍的临床疗效，改善代谢紊乱。此外，口服GUDCA补充剂或FXR拮抗剂可能在Ⅱ型糖尿病的治疗中具有潜在的转化意义。
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文献ID
题目：Gut microbiota and intestinal FXR mediate the clinical benefits of metformin
译名：肠道微生物和肠道FXR介导二甲双胍的临床疗效
期刊：Nature medicine
发表时间：2018 IF：32.621
通讯作者：姜长涛
通讯单位：北京大学基础医学院
材料与方法
样品来源
22例新确诊的经二甲双胍治疗的Ⅱ型糖尿病患者
样品收集
粪便、血液
研究方法
宏基因组测序、代谢组学分析
研究成果
1、二甲双胍可以改善糖尿病患者的肠道菌群和胆汁酸代谢
基因总数无较大差别，而二甲双胍处理组中的α多样性略有降低；PLS-DA分析显示二甲双胍处理后，患者的肠道菌群发生改变（图1a），其中Bacteroides finegoldii和B. fragilis是两组中最重要的区分物种（图1b）；宏基因分析结果显示二甲双胍处理组中拟杆菌属的相对丰度显著降低，其中B. fragilis的降低程度最明显（图1c）。
Blautia obeum和B. fragilis是调节次级胆汁酸代谢通路中主要的物种；经二甲双胍处理后，血清和粪便中的次级胆汁酸GUDCA和TUDCA含量显著增加（图1d）；总胆汁酸水平不变，结合胆汁酸/未结合胆汁酸比例增加，12α-OH胆汁酸/不含12α-OH胆汁酸比值没有明显变化。
图1 口服二甲双胍改善糖尿病患者肠道微生物组成和胆汁酸代谢
2、FXR拮抗剂—GUDCA
经二甲双胍处理后，2型糖尿病患者的血清FGF19水平显著降低，而7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮（C4）水平显著增加，表明肠道FXR信号被抑制，肝脏CYP7A1活性增加（图1e,f）。
进一步通过分子对接、TR-FRET FXR共激活因子检测以及荧光素酶报告基因检测等技术发现GUDCA和TUDCA是FXR的拮抗剂（图2a），可以显著性抑制CDCA诱导的FXR转录活性（图2b）。
在CaCo-2细胞中，GUDCA和TUDCA可以抑制CDCA诱导的FXR靶基因（SHP和FGF 19）mRNA表达（图2c）；同时荧光素酶报告基因检测显示GUDCA对TGR5的活性无影响。
为了在体内检测GUDCA和TUDCA对FXR信号的抑制作用，给予抗生素处理组小鼠TCA、CDCA、GUDCA和TUDCA。结果发现CDCA提高了TCA诱导的肠道FXR信号，而GUDCA和TUDCA降低了TCA诱导的肠道FXR信号（图2d）。综上，GUDCA和TUDCA在体内体外都是潜在的FXR拮抗剂。
图2 新的FXR拮抗剂——GUDCA和TUDCA（图a-d）
3、二甲双胍通过肠道微生物以AMPK无关的方式抑制肠道FXR信号
二甲双胍处理组小鼠的回肠中TβMCA和TUDCA水平明显升高，FXR靶基因（Fxr、Shp、Fgf15）mRNA表达量显著下调，而肝脏中靶基因的相对表达量无明显变化（图2e）。同时由于肠道FXR-FGF15信号的减弱，导致肝Cyp7a1 mRNA表达上调（图2f）。
为了进一步确认二甲双胍抑制肠道FXR信号是否依赖于AMPK，实验采用Ampka1∆IE和Ampka1fl/fl小鼠研究FXR靶基因表达情况。结果发现二甲双胍仍可以显著改善肠FXR信号（图2g）。
为了探究二甲双胍抑制肠FXR信号是否依赖于肠道微生物，实验采用抗生素处理鼠进行研究。结果发现二甲双胍可以抑制肠道FXR信号，然而抗生素联合二甲双胍处理组中FXR信号抑制能力较弱（图2h）。与肠道FXR情况相似，二甲双胍处理组中TβMCA和TUDCA的水平显著增加，然而抗生素联合二甲双胍处理组中未发现明显的变化；同时，二甲双胍也不能抑制抗生素处理组中诱导的肠道FXR信号，以上结果表明二甲双胍抑制肠肠FXR信号依赖于肠道微生物（图2i）。
图2 新的FXR拮抗剂——GUDCA和TUDCA（图e-i）
4、B. fragilis与二甲双胍处理中的FXR信号和胆汁酸代谢相关
B. fragilis与粪便和血清中GUDCA和TUDCA的水平呈负相关关系（图3a），与血清中FGF19的水平呈正相关关系，而与血清中C4水平呈负相关关系（图3b）；二甲双胍直接抑制B. fragilis的生长并呈现为剂量依赖性（图3c）；KEGG分析发现B. fragilis在叶酸合成和单碳池产生途径中发挥着重要作用。代谢组学分析表明，二甲双胍处理组中甲基供体——5-甲基四氢叶酸的水平升高，蛋氨酸水平降低（图3d，e）；补充蛋氨酸可以恢复二甲双胍对脆弱拟杆菌的抑制作用（图3f）。
利用宏基因组分析研究GUDCA和TUDCA的积累是否是由于二甲双胍抑制了BSH的活性。二甲双胍处理后B. fragilis的Bsh基因拷贝数和BSH活性显著降低（图3g，h）且GUDCA的解离作用显著降低，但用BSH抑制剂——咖啡酸苯乙酯（CAPE）的处理效果不明显（图3i）。而且，发现二氢叶酸还原酶抑制剂甲氧苄啶（TMP）能抑制脆弱杆菌介导的GUDCA水解（图3j）。在喂食HFD的小鼠中，补充甲氧苄啶可模拟二甲双胍对胆汁酸代谢和肠道FXR信号的影响（图3k,l）。
图3 二甲双胍诱导的脆弱杆菌丰度与胆汁酸谱的调节呈负相关
5、B. fragilis可抑制二甲双胍对糖代谢的改善作用
将四名服用二甲双胍前（trans-BM）和服用二甲双胍后（trans-AM）的糖尿病个体的粪便移植给抗生素处理的HFD小鼠。结果发现，trans-AM组小鼠中B. fragilis丰度降低、体重略有减少、糖耐量和胰岛素抵抗增加、肠道TβMCA和TUDCA水平增加，肠FXR信号传导受到抑制。
HFD小鼠分别灌胃B. fragilis活菌和热处理的B. fragilis。结果发现，B. fragilis的定植导致体重增加、糖耐量和胰岛素敏感性降低、TβMCA和TUDCA的水平显著降低、肠FXR信号传导激活。研究表明，肠FXR信号抑制可使白色脂肪组织褐变从而改善肥胖等相关代谢疾病。实验发现B. fragilis可导致皮下脂肪组织（sWAT）中的热原基因mRNA（Ucp1, Elovl3和Pgc1a）的相对表达量明显下调，而附睾白色脂肪组织（eWAT）或棕色脂肪组织（BAT）中则无明显变化。
为了进一步阐明脆弱拟杆菌是否参与了二甲双胍对代谢性疾病的临床疗效，给二甲双胍治疗小鼠灌胃4周的B. fragilis。结果发现，补充B. fragilis使小鼠体重增加、糖耐量和胰岛素敏感性降低（图4a-f）、能量消耗降低（图4g），然而食物摄入量并未受到影响。同时，B. fragilis处理组中TβMCA和TUDCA水平明显上调、肠道FXR信号传导受到抑制（图4h，i）、SWAT中热原基因mRNAs相对表达量明显下调（图4j）。
为进一步探讨脆弱拟杆菌的胆盐水解酶活性在代谢性疾病临床治疗中的作用，抗生素处理小鼠感染B. fragilis后，对其进行二甲双胍或CAPE联合二甲双胍灌胃。结果发现，二甲双胍可明显改善脆弱杆菌定植所导致的代谢功能障碍，而二甲双胍联合CAPE灌胃的小鼠与单独使用CAPE灌胃的小鼠相比无较大差别。二甲双胍明显抑制脆弱杆菌诱导的肠FXR信号，与CAPE处理组无较大差别。
图4 B. fragilis可抑制二甲双胍对糖代谢的改善作用
6、肠FXR对于二甲双胍诱导的代谢改善是必不可少的
为了进一步探讨肠FXR在二甲双胍治疗疾病中的作用，对Fxr∆IE和Fxrfl/fl小鼠分别灌胃12周的二甲双胍。结果发现，二甲双胍对Fxrfl/fl小鼠中糖耐量、胰岛素敏感性、能量代谢等有显著的改善作用，而二甲双胍对Fxr∆IE小鼠中的相应指标无明显影响（图5a-i）。同时，免疫组化和Western blot等技术的分析结果和上述一致（图5j，k）。
图5 肠FXR对于二甲双胍诱导的代谢改善
7、GUDCA对糖耐量和胰岛素抵抗的改善作用
因为GUDCA是一种新型的FXR拮抗剂，因此进一步探究GUDCA是否可以在体内产生代谢效应。结果表明，口服GUDCA可以抑制肠FXR信号传导，但并不影响肝脏中FXR信号传导（图6a）。胆汁酸谱分析显示，GUDCA和TUDCA明显升高，而其他胆汁酸代谢物无变化（图6B）。GUDCA对Fxrfl/fl小鼠中糖耐量、胰岛素敏感性、能量代谢等有显著的改善作用，而GUDCA对Fxr∆IE小鼠中的相应指标无明显影响。
对肥胖小鼠灌胃4周的GUDCA，发现GUDCA对血糖、胰岛素、能量摄入、血清GLP-1等均具有显著的改善作用（图6c-k）。
图6 GUDCA对糖耐量和胰岛素抵抗的改善作用
研究结论
该研究利用宏基因组和代谢组学分析手段，结合体内体外实验，探究二甲双胍改善糖尿病的作用机制。研究发现二甲双胍可以改善肠道微生物，降低脆弱拟杆菌的丰度，从而抑制胆盐水解酶活性，使得GUDCA水平升高，最终抑制肠FXR信号的激活，从而达到改善血糖稳态的目的。
亮点
该文首次二甲双胍改善糖尿病的代谢通路——菌群—GUDCA—FXR轴进行研究，探究肠道微生物和肠FXR介导二甲双胍的临床疗效，阐述了二甲双胍改善糖尿病的作用机制，为治疗糖尿病提供了新的靶点。
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供稿：党芳芳
编辑：鲁淑妮
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