相比于我们之前介绍过的 WB、IHC 和 IF 等实验，FCM 对仪器设备、试剂质量和操作技巧等方面的要求更高，实验中也容易出现各种问题，不仅浪费科研成本，也影响操作人员的心情。因此，小编整理了一些 FCM 中的主要问题以及相应解决方法，来帮助大家避开实验中的误区。
一、背景的荧光强度过高
背景荧光强度高意味着非特异性染色明显，这类问题一般和抗体的非特异性结合、样品自发荧光等多个方面的因素有关。在排除实验中的试剂质量问题以及不规范操作所带来的干扰之后，主要原因如下：
1. 抗体浓度过高。实验中如果荧光标记的抗体浓度过高，背景会因为非特异性结合的增加而增加，建议在实验中优化抗体的使用浓度。
2. 一抗和细胞表面或胞内结构的非特异性结合。为了避免这一类问题，在使用一抗之前，可将样品与过量的蛋白一起培育，如牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪等。
3. 二抗与一抗或细胞表面、胞内结构之间的非特异性结合。为了避免这一类问题，可在使用一抗之后，将样品与5%至10%的来自同一宿主的正常血清和作为标记的二抗一起孵育。
4. Fc 受体对实验结果的干扰。Fc 受体会表达在多种细胞表面，如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞等，能够结合抗体的 Fc 部分，导致检测结果的假阳性。对于这类样品，在实验中建议使用合适的 Fc 受体阻断剂。
5. 样品的自发荧光。不同类型的样品及培养基中的成分都会有不同水平的自发荧光，例如核黄素、黄素辅酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交联、线粒体、溶酶体和 NADH 等。其中粒细胞特别容易出现自发荧光，因为细胞内的蛋白和分子在低波长时易被激发，且发射波长在500~700nm，与一些常见的荧光素（如 FITC、PE）重叠。所以对这类样品建议设空白对照检测样品的自发荧光水平。
6. 荧光染料的影响。选用荧光染料时需要注意，花青素染料和部分串联染料容易结合到 Fc 受体（尤其是单核细胞），并且无法通过 Fc 受体阻断剂阻断。同时，串联染料对某些固定剂也很敏感。这些因素都会对结果分析产生干扰，在实验中应该根据具体的实验情况选用合适的荧光染料。
二、信号强度低
在 FCM 的实验结果中，有时会出现细胞染色呈阳性但很弱的情况，与预期的实验结果不相符，其中可能的原因主要有以下几个方面：
1. 一抗浓度较低或者荧光染料选择不合适。可以考虑适当增加抗体浓度，对于表面抗原表达量低的样本，应选择荧光强度高的染料，如PE，APC 等。
2. 抗体储存问题。带有荧光染料的抗体在冷冻条件下可能会出现沉淀和聚集的现象，因此抗体应该按要求的条件保存，避免冷冻。
3. 抗原表达问题。抗原表达水平与抗原表达位置需要根据相关文献而确定；此外，有的标记和细胞因子需要诱导才能表达并与相应的抗体结合。实验中，需要根据实际条件选择合适的方法进行检测。
4. 细胞在染色前固定或破膜。固定和破膜会改变抗原表位和抗体间的相互作用，这种敏感性具有抗原依赖性和克隆依赖性。其中，有的抗原位点需要固定后才能与抗体结合并被检测出，因此需要根据具体条件来选择合理的实验流程。
5. 前带效应。高浓度抗体聚集会阻碍特异性抗体和抗原的结合，从而引起较弱的染色结果，通过适当稀释抗体可有效改善这一情况。
三、结果阴性
在有的 FCM 实验中，会出现未能成功染色的结果，这种情况如果排除仪器操作或试剂质量上的问题，一般可能的原因有以下几点：
1. 细胞损失严重。在洗涤离心、加样步骤中丢失细胞或弃上清时带走细胞从而导致结果呈现阴性。所以在操作时需要小心谨慎，避免这一类问题导致实验失败。
2. 抗体使用问题。实验中选用可用于流式实验的抗体，同时确保抗体在有效使用期内。此外，一抗与二抗之间的结合以及抗体是否标记合适的荧光染料也是需要注意的问题。
3. 样品的抗原表达。确定样品是否成功表达了需要检测的抗原，同时建议设一组已知表达该抗原的样品作为阳性对照。
4. 荧光标记的激发。根据实验要求选择相应的荧光标记，并根据荧光标记使用正确的激发波长和分析通道。
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