Bai Lab时讯：在成骨细胞中特异性敲除IGF受体基因揭示了IGF信号在体内骨基质矿化的作用

许多体外和体内研究正在逐步进行揭示了IGF系统对骨骼发育和代谢控制的重要性。 IGF1通过刺激软骨细胞的增殖板，参与骨小梁的形成。软骨细胞和骨细胞产生IGF并表达IGF1R。使用成骨细胞培养的研究显示IGF1刺激成骨细胞增殖，加速分化，增强骨质基质。此外，IGF1被认可为骨细胞存活的关键因素。IGF1 也直接或调节骨吸收通过对成骨细胞的作用，反过来刺激成骨细胞 破骨细胞的形成和功能。在转基因小鼠实验中，出在成骨细胞中靶向过表达IGF1的小鼠表现出骨形成率增加，骨小梁和皮质骨体积增加。值得注意的是，这些变化发生了却没有增加成骨细胞的总数，表明局部产生的IGF1可以发挥作用，它的合成代谢作用主要是通过提高成骨细胞的性能。

哺乳动物的体型和线性骨骼生长受到细胞信号通路的影响，并且受生长因子和激素的控制。在这方面，一个主要的增长促进信号：由胰岛素样生长因子（IGF，1 IGF1和IGF2）和1型IGF受体（IGF1R）组成调节胚胎生长，。通过IGF1R起作用的IGF1起着重要作用，他会调节出生后激素的功能。通过IGF1R酪氨酸发出信号激酶受体不仅促进细胞增殖，而且促进细胞增殖介导抗细胞凋亡作用。IGF系统包括，1、第二受体（IGF2R）（缺乏信号传导特性，但是用于IGF2的转换，包括至少六种功能模糊的IGF结合蛋白（IGFBPs））2、IGF：在各种组织中局部产生，包括骨骼，并发挥自分泌/旁分泌功能，但它们也存在于血清中，主要与IGFBPs有关。循环IGF是否作为激素系统起作用，目前存在争议。

图1.表达Cre的转基因小鼠的发育。一个用于产生的人骨钙蛋白（hOC）DNA构建体的图 携带Cre转基因的小鼠品系。克隆该构建体是 在“材料和方法”中描述。箭头表示转录方向。 B，OC-Cre转基因的Northern印迹分析 在表达Cre的小鼠的组织中表达。十微克将总RNA的凝胶分离，转移到尼龙中 膜，然后与Cre cDNA杂交（上图）。该 18S核糖体RNA的溴化乙锭染色显示在底部面板。

图2.估计Cre介导的重组的起始和效率小鼠组织中的水平。 A，Z / AP转基因图从Ref。修订的构造22.的立场和方向两个loxP站点由灰色三角形表示。 B，从E16,17和E18.5 OC-Cre / Z / AP胚胎染色为碱性 磷酸酶。 E16颅盖骨中不存在AP阳性细胞，但很明显存在于初级骨化中心的E17颅盖骨中。 C，X-gal-和 碱性磷酸酶染色的颅骨切片（放大10倍） 来自Z / AP小鼠（ZAP）和来自OC-Cre和Z / AP的后代 双转基因小鼠（第6行）。 Calvaria来自后代 OC-Cre / Z / AP杂交显示X-gal染色显着减少 以及成骨细胞谱系细胞中AP的出现。该 最右边的面板显示了更高的放大倍数（60）的碱性 来自OC-Cre / Z / AP小鼠的颅盖中的磷酸酶阳性骨细胞。 D，OC-Cre和Z / AP的代表性非骨骼组织切片来自OC-Cre系6的双转基因小鼠。

图3. 成骨细胞特异性Cre介导的纯合子重组 Igf1rflox/flox条件突变小鼠也携带 OC-cre转基因。A，外显子区域3的部分限制性图谱野生型（WT）小鼠Igf1r基因座的4个（黑色矩形）。条件 Cre介导的外显子3切除前后的突变等位基因显示了侧翼序列（分别为Igf1rflox和Igf1r flox）。 floxP站点（灰色三角形）不是按比例的。 KpnI（K）的大小 DNA片段和用于PCR的引物（1,2和3）的位置分析.B，来自Igf1r的器官中Cre介导的重组的PCR分析 老鼠。使用来自组织的DNA模板进行PCR分析在“材料和方法”中描述的Igf1r小鼠后代。上图显示了由引物1和3产生的PCR片段。特异于重组等位基因（flox）。检测到重组 仅在骨骼组织中。下图显示了PCR片段 由对非重组等位基因特异的引物2和3产生 （FLOX）。

 

图4. Igf1r的破坏降低了骨形成率。用连续剂量的钙黄绿素标记3周龄雌性小鼠并且在骨骺中定量骨形成的动态指数女性控制股骨小梁（黑色条，n7）和Igf1r小鼠（灰色条n7）如“材料和”中所述方法。数据代表平均值S.E. *，p=0.05。

 

图5. Igf1r中骨基质的矿化受损老鼠。 上图，6周龄雌性小鼠用顺序标记定量测定钙黄绿素的剂量和骨形成的动态指数 如“材料”中所述，在股骨的干骺端小梁中 和方法。“A和C”栏显示H E染色的切片 突变体（左）和对照（右）小鼠股骨。增加了类骨质（白色箭头）的数量和成骨细胞的大小和数量（Ig箭头小鼠）在骨骼中显示出（黑色箭头）。小组B 和D显示来自的远端股骨的代表性钙黄绿素标记的切片突变体（左）和对照（右）小鼠。 底部面板，矿化 女性控制中的沉积率和矿化滞后时间（黑色 barn 10）和Igf1r小鼠（灰色条，n 8）。数据代表 意思是S.E. *，p=0.05。

 

图6. 减少Igf1r小鼠的骨量。在股骨远端进行组织形态学测量 6周龄雌性对照（黑色条，n 10）和Igf1r小鼠（灰色如“材料和方法”中所述，如“数据和方法”所述意思是S.E. *，p 0.05; **，p 0.01。

图7. Igf1r小鼠骨微结构的变化。微 在6周龄女性的股骨远端进行CT分析 Igf1r和对照小鼠。 A，骨小梁体积值，小梁控制的分离，数量和连接密度（黑条，n 7） 和Igf1r小鼠（灰色条，n 9）。 数据代表平均值S.E。 *，p 0.05; **，p 0.01。 B，代表性的远端三维图像来自对照的股骨和分辨率为34微米的Igf1r小鼠。插页显示了9微米分辨率的重建骨小梁图像。