单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂，单克隆抗体可以充分发挥其优势，如特异性好，灵敏度高，更便于质量控制，利于标准化和规范化。传统的方法是利用小鼠腹水制备单克隆抗体，但是近几十年杂交瘤细胞体外大规模培养制备单克隆抗体技术也在不断发展。特别是单克隆抗体在疾病诊断和治疗方面的需求，更进一步促进了杂交瘤细胞体外培养生产技术的发展，体外培养杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面。由于杂交瘤细胞的半贴壁性质，无论是悬浮培养还是贴壁培养，均可进行杂交瘤细胞的体外大规模培养。针对应用于体外诊断试剂的杂交瘤细胞体外培养制备单克隆抗体进行综述，主要包括中空纤维细胞培养和生物反应器细胞培养方法，以及不同培养方法优化的进展。
1975 年，英国科学家Milstein和Kohler发明单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，开创了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代，与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。单克隆抗体杂交瘤技术是当代免疫学中最重要的技术革命，它的问世极大地推动了医学-生物学的发展。单克隆抗体具有非常广泛的应用，特别是在体外诊断和疾病治疗等方面。人用治疗的抗体药物主要采用基因工程重组抗体，由CHO、SP20、NS0等细胞表达，而基于杂交瘤细胞培养生产的单克隆抗体目前主要应用于诊断试剂及动物治疗。
目前大部分体外诊断用单克隆抗体的制备主要采用体内法，将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长，并产生腹水，因而可得到大量的且抗体浓度很高腹水单抗。小鼠体内杂交瘤细胞培养，腹水中抗体含量浓度高，产量大，可持续抽取，不需要培养基等成本，不需要重复无菌操作，快速简便，但腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括IgG) 和脂类物质等，在很多情况下必须要提纯后才能使用，还有动物病毒污染的危险，另外由于小鼠个体差异较大，导致产品批间差较大。因此在无/低血清条件下的杂交瘤细胞的体外大量培养成为当前研究的主要方向。
杂交瘤细胞体外培养法制备单克隆抗体工艺的建立，通常需要经过以下4个阶段:小鼠骨髓瘤细胞的选择、细胞融合和单克隆筛选;鼠杂交瘤细胞体外培养方式的选择;杂交瘤细胞体外培养的工艺优化;纯化工艺的建立和优化。体外培养鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体主要有两种方式，中空纤维系统培养和生物反应器培养，中空培养系统的优势有:①细胞密度高(＞108cells /ml) ，②营养物质能有效地分布，代谢废物能及时除去，③维持时间长，可达数月，特别适于长期连续培养，④培养系统占用空间小;劣势有:①放大困难，适用于年需求量小于10g的产品，②耗材为一次性的且价格稍高，一旦出现污染，就必须废弃耗材，增加成本。生物反应器培养的优势有:①易放大，几升到几百升甚至几千升均可，②工艺成熟稳定，③根据不同的需求，可以选择不同的培养工艺，批式培养，流加补料培养或者灌流培养;劣势有:①培养液抗体浓度偏低;②下游纯化体积较大。针对体外诊断用单克隆抗体，综述杂交瘤细胞两种培养系统的特点、选择、培养工艺的优化以及目前的研究进展和应用成果。
1 杂交瘤细胞的特点和培养方式
鼠杂交瘤细胞系是由小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合形成的。一般来讲，鼠杂交瘤细胞不是一种严格的贴壁依赖性细胞(anchorage dependent cell，ADC)，属于半贴壁性质的细胞，既可以贴壁培养，也可以悬浮培养，但不同的细胞系之间的贴壁依赖性有差异。中空纤维系统主要是贴壁培养，生物反应器培养既可进行悬浮培养，又可借助微载体进行贴壁培养。体外诊断用单克隆抗体与治疗用单克隆抗体的需求量不同，体外诊断用抗体的年需求量比较少，一般10 ～100g /年，但是细胞株种类较多，个别特殊用途抗体如阻断剂的年需求量最多可达1～2kg /年，而生物制药用抗体需求量一般100～1 000kg /年。
生物反应器是最常用的制备单克隆抗体方法，在诊断试剂行业，转瓶和中空纤维系统也较常用。培养方式包括批式培养、流加补料培养和灌流培养，灌流培养是最有效的生产小规模单克隆抗体的方法，中空纤维系统是灌流培养，生物反应器系统既可以进行批式培养或者流加补料培养，也可进行灌流培养。灌流培养可以不断加入新鲜的培养基，排出代谢废料，从而使细胞快速达到高密度，高细胞密度可以实现高抗体分泌和高产能，有研究表明，灌流培养的产能比批式或流加培养高10倍多。RaisaV 等统计比较了生物反应器和中空纤维系统制备单克隆抗体的区别，包括成本区别(如图1和图2所示)和产能区别(如表1所示)。成本包括直接成本和间接成本，直接成本包括核心原材料、耗材、杂项、人力、QA/QC，间接成本包括通用设备、维持费用和折旧费，两者的主要区别是生物反应器设备折旧费占比较高，达39%，而中空系统设备折旧费占25%，中空系统比生物反应器系统多出10%的耗材成本;产能区别，10L生物反应器灌流培养年产能425g，抗体浓度0.17mg/ml，单根70ml中空纤维柱批产能10.6g，年生产5批，每批次同时培养8根中空纤维柱子，可实现年产能425g，每克抗体的成本，两者差别不大，生物反应器比中空纤维系统高7%。
2 中空纤维系统培养杂交瘤细胞
20世纪70年代初期出现中空纤维细胞培养技术，1972年Knazek等报道了他们设计、制造的小型中空纤维细胞培养装置及细胞培养的实验结果，证实细胞能在中空纤维上形成类似组织的多层细胞。目前美国有多家公司在进行中空纤维系统的研发和生产，如FiberCell公司、CellCulture Company 公司等。中空纤维系统可以在很小的体积内提供非常大的表面积，FiberCell公司有柱腔体积为15ml的中号中空纤维生物反应器(C2011 and C2008，FiberCellSystems) ，能提供2200cm2的表面积，也有柱腔体积为60ml的较大的反应器(C2018 和C2003)可以提供1.2m2的表面积。CellCulture Company 可以提供柱腔体积为150ml的反应器，可以提供2.1m2的表面积。
中空纤维生物反应器的一个特点是培养的细胞密度可以超过108cells /ml，可以获得较高浓度抗体;中空纤维生物反应器和其他细胞培养技术的另一个基本区别在于:中空纤维能形成易于细胞附着的多孔渗滤支撑，最类似于活体内的细胞生长方式，由于营养输送是由下至上的，因此细胞很容易彼此堆积，形成一个具有多层细胞的层面。中空纤维生物反应器的第三个特点是可通过中空纤维膜孔径(或截留分子量)选择性地控制不同分子量物质进出中空纤维膜，营养物物质和代谢废物进行交换，带进来营养物质，排出代谢废物，而目标产物一直累积，不能透过中空纤维膜。最常见的例子是用于杂交瘤细胞株生产单克隆抗体，这是中空纤维生物反应器的第一次大规模应用。功能型的中空纤维膜的孔径是20～30kDa，中空纤维柱内循环是含血清的培养基，不断提供营养物质，外循环是细胞生长的空间，内循环培养基中的氨基酸、无机盐、维生素以及血清中的小分子物质可以透过中空纤维膜供细胞利用，外循环细胞代谢产生的乳酸以及葡萄糖等代谢废物可以通过中空纤维膜被带走，每天更换内循环培养基，收获外循环抗体，从而实现杂交瘤连续培养，长期收获目标抗体。由于中空纤维系统表面积大而培养体积小，且细胞数量可达109以上，因此收获的抗体浓度相对较高。中空纤维培养系统的培养周期较长，根据需求一般在1～6 个月不等。
Legazpi 等用分子截留量为30kDa，表面积为2050cm2的中空纤维柱培养HB-8852杂交瘤细胞，在整个培养过程中，葡萄糖的含量从4.5g/L 逐渐降低到3g/L，谷氨酰胺的含量从0.4g/L 逐渐降低到0.2g/L，连续培养16天，抗体分泌0.27mg/ml，揭示了中空纤维系统培养杂交瘤细胞的代谢动力学，但此细胞株的抗体分泌能力相对偏低，摇瓶培养抗体分泌0.03mg/ml。
R van Erp 等应用中空纤维系统培养鼠杂交瘤细胞制备2株hCG单克隆抗体，转瓶培养制备细胞种子，制备种子时用含10%血清的DMEM/F12培养基，将处于对数期的细胞以5× 106 cells /ml 的密度接种到中空纤维系统外腔，接种后2周，以2次/周的频率收获中空纤维系统外腔液，可以连续培养80天，细胞密度平均可达到7× 107 cells /ml，抗体分泌平均可达到4mg/ml。Jackson等评价了用体外法中空纤维系统培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体替代体内腹水法制备单克隆抗体的可行性，选取3株杂交瘤细胞，分别用体内法和体外法中空纤维系统制备单克隆抗体，制备周期65天，结果表明，细胞株2B11，体内法产量455mg，体外法产量211mg，细胞株3C9，体内法产量446mg，体外法产量565mg，细胞株RMK，体内法产量997mg，体外法产量1023mg，体内腹水法平均的抗体浓度为4.07～8.37mg/ml，体外中空纤维培养平均的抗体浓度0.71～11.1mg/ml，证明了中空纤维可以用于年需求量5g以下抗体的体外制备。
3 生物反应器培养杂交瘤细胞
杂交瘤细胞培养系统有多种不同的类型和规模，包括滚瓶细胞培养系统、搅拌式生物反应器、气升式生物反应器和一次性生物反应器，每一种生物反应器都有其自身的特点和应用，培养规模从几升、几十升、几百升到几千升不等，目前行业应用最广泛的是搅拌式生物反应器。但由于不同株的杂交瘤细胞的抗体分泌能力不同，对营养需求的需求也可能有差别，最适应的培养基也可能不同。鼠杂交瘤细胞体外培养产生单克隆抗体，受很多因素的影响，促进剂、抑制剂以及添加物等，许多科学采取多种方式提高体外杂交瘤细胞培养生产单抗的能力，如基因工程改造、单克隆重新筛选、营养物质优化等。用生物反应器培养杂交瘤细胞需对生物反应器控制参数和营养物质进行双重调控。
3.1 生物反应器参数调控
最经济有效的单抗制备过程，需要充分理解生物反应器程参数对细胞生理过程的影响，因此必须评估细胞生长、营养消耗和抗体分泌的动力学参数，这些参数对工艺放大也是十分有用的。Ayyildiz等比较了滚瓶培养系统(modular cell production roller culture apparatus ) 、搅拌式生物反应器(Biostat B plus cc，Sartorius，5L) 和一次性细胞静止培养系统(CELLine CL350，Sartorius) 培养A5A8株杂交瘤细胞，制备抗沙门氏菌O型特异性抗原的单克隆抗体，以期了解不同的生物反应器过程参数对单抗制备的影响，如细胞密度、细胞活率、葡萄糖和谷氨酰胺消耗、乳酸和氨的产生以及抗体的分泌等。结果表明，当细胞在10%血清DMEM/F12培养基中培养，生物反应器培养优于一次性细胞静止培养系统，一次性细胞静止培养系统优于滚瓶培养系统，三者的抗体比生产速率分别为20mg/L /d、16mg/L /d、5mg/L /d。
最常用的搅拌式生物反应器，在培养过程中影响细胞生长和抗体产能的因素包括:生物反应器过程参数，比如温度、溶氧、pH、搅拌;营养物质和代谢废物，如葡萄糖、氨基酸和肾上腺皮质酮;以及诱导抗体分泌的化学物质，如丁酸钠。当然这些因素的变化，也有可能影响抗体的电荷分布、糖型以及可能会出现结晶现象。如下表所示:
Agarabi 等利用DOE实验设计中Plackett-Burman设计方法，设计了12组实验，验证了2水平11个参数对生物反应器培养杂交瘤细胞制备鼠IgG3单抗的影响，11个参数包括溶氧、温度、搅拌、通气、接种密度、pH、变温、补料策略、非必需氨基酸、脂肪酸和皮质醇。结果表明，12组实验抗体分泌在20mg/L ～120mg/L不等，其中生物反应器过程参数对细胞密度并无产生持续的显著影响，但搅拌速度和温度对细胞密度的影响比添加脂肪酸要显著;适当水平的葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长和抗体分泌有利;不同补料策略对细胞生长和抗体分泌影响不大;温度降低至34℃后，抗体产量降低，有趣的是也有研究表明温度降低后抗体产量升高。
3.2 营养物质优化
杂交瘤细胞体外批式培养细胞密度和抗体分泌均不高。JoEC 等体外培养分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株，主要在三角瓶中培养，采用重复加强补料的策略，应用特定的基础培养基和补料培养基，培养培养基所含的营养是RPMI-1640基础培养基的50倍，补料的依据是葡萄糖浓度维持在1g/L，每天补加10%初始体积的补料，同时去除10%体积，以维持培养体积的稳定，70h达到最高细胞密度1× 107 cells /ml，之后细胞密度在0.5× 107 cells /ml 维持2500h，抗体分泌达到1g/L 维持2500h。
众所周知，细胞培养过程中导致细胞死亡的不仅仅是葡萄糖或氨基酸的缺乏，还包括代谢毒素的累积，如谷氨酰胺代谢产生的氨和糖酵解产生的乳酸等。适当降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度，可以减少氨、乳酸等代谢废物的累积，但如果葡萄糖和谷氨酰胺的浓度过低，而补料不能及时供应细胞生长所需的营养物质，也可能导致细胞快速死亡。因此需合理控制营养物质的浓度，使细胞不因营养物质缺乏而死亡，也不因代谢废物累积而死亡。20世纪90年代，Xie等做了大量工作，通过研究杂交瘤细胞代谢动力学进行培养基和补料研究，分析细胞生长代谢所需的营养物质和能量，进行流加补料培养，最大活细胞密度从6.3× 106
cell /ml 提高到1.7× 107 cells /ml，培养周期从340h提高到550h，最终抗体分泌达2400mg /L，葡萄糖转化成乳酸的比例由67%降低至3.4%。
常规杂交瘤细胞培养用含血清的基础培养基，DMEM或者DMEM/F12均可，但是随着无血清培养基技术的发展，也出现了多种杂交瘤细胞无血清培养基和低血清培养基。Keisuke等研发出了一种血清替代物，用于体外培养可分泌人纤连蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞CRL-1606(购自ATCC)，此血清替代物包含12种组分，胰岛素(0.017mmol /L) 、转铁蛋白(0.001 3mmol /L) 、对氨基苯甲酸(0.015mmol /L) 、盐酸吡哆醇(0.11mmol /L) 、亚硒酸钠(0.000 38mmol /L) 、丙酮酸钠(7.5mmol /L) 、次黄嘌呤二钠(0.074mmol /L) 、亚油酸(0.000 73mmol /L) 、硫辛酸(0.002 5mmol /L) 、腐胺(0.002 5mmol /L) 、胸苷(0.007 5mmol /L) 、谷胱甘肽(0.008 1mmol /L) 。生物反应器(1L，AbleCo，Japan)培养体积为800ml，根据细胞的营养物质消耗情况，每12h进行一次补料，整个培养过程持续了25d，最大活细胞密度达3× 106 cells /ml，抗体分泌400mg/L，抗体分泌较补料前提升了5倍。Chua等研制了一种低血清培养基，DMEM基础培养基添加0.4%胎牛血清、311.8mmol/L 柠檬酸铁、17.3nmol/L sodium 亚硒酸钠和4.5mmol/L 硫酸锌，相比对照组用2%胎牛血清，低血清培养基成本降低64.6%，而单细胞抗体分泌能力提升了3倍。
Cherlet 等应用2L生物反应器培养可分泌人T淋巴细胞CD3单抗的杂交瘤细胞，验证了丁酸盐对杂交瘤细胞的影响，丁酸盐可以促进杂交瘤细胞抗体分泌，但会抑制杂交瘤细胞的生长，因此要选择合适的时间进行添加合适浓度的丁酸盐，在细胞对数期进行1mmol/L 丁酸盐的添加，抗体分泌可提高1倍。Rokni等研究了微量元素全反式维甲酸(ATRA) 和不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA) 在体内和体外对鼠杂交瘤细胞抗体分泌的影响，设置了3个实验组和1个对照组，单独添加ATRA，单独添加DHA，配合添加ATRA和DHA，结果表明单独添加1μmol/L ATRA 或10μmol/L DHA，抗体分泌有了提升，其中ATRA的促进效果优于DHA，配合添加0.5μmol/L ATRA 和5μmol/L of DHA也可促进抗体分泌，与单独添加10μmol/L DHA 的除抗体分泌效果基本一致，抗体分泌提高1倍。Konno等的研究表明添加辅酶Q10也可促进抗体的分泌。
4 展望
随着单克隆抗体技术的发展，成千上万的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株已被开发出来，体外杂交瘤细胞大规模培养方法和设备也在不断的发展。针对快速发展的体外诊断领域，单克隆抗体的需求量不断增加，而小鼠饲养规模的限制以及法规环评的限制会进一步促进杂交瘤细胞体外培养技术的快速发展，目前有多家体外诊断企业均在进行杂交瘤细胞体外培养技术研发，同时对于诊断试剂用部分抗体，也在积极进行重组抗体开发，以期提高抗体质量。
参考文献
中国生物工程杂志,2018,38(10)
联系客服
