多个RBPs协同完成细胞多能性诱导不同时期的AS动态调控

几种可变剪接形式

文章简介

文章题目	Multiphasic and Dynamic Changes in Alternative Splicing during Induction of Pluripotency Are Coordinated by Numerous RNA-Binding Proteins
中文题目	多个RBPs协同完成细胞多能性诱导不同时期的AS动态调控
期刊名	Cell reports IF: 7.87
作者	Benjamin Cieply, Juw Won Park, et al.
发表时间	2016.04
实验材料	MEFs from mice harboring a doxycycline (Dox)-inducible polycistronic OKSM cassette
测序平台	Illumina HiSeq 2500 sequencer
相关产品	RNA-seq

研究背景

前期转录组数据显示，小鼠胚胎纤维母细胞（MEFs）向诱导多能干细胞（iPSCs）重编程过程是一个多步骤过程，其中包含明显的不同时期的特征，然而在这一多能诱导过程中的多时期可变剪接事件的检出工作还未开展。本项研究基于以上目的，对诱导过程中不同时期的细胞进行了转录组的检测，并且对AS事件进行了深入的鉴定和验证，同时与AS相关联的RBPs同行了同步研究。

研究内容

对MEFs向iPSCs诱导过程中的不同时期的AS动态变化进行了研究。

研究内容

RNA-seq；

放射性标记RT-PCR；

图形概要

研究成果

1.体细胞重编程过程中剪接动态改变的全面时空分析

作者团队在前期已经构建了使用可以用多柔吡星（Dox）诱导Oct4, Klf4, Sox2, 和 cMyc（OKSM）多能诱导因子表达，从而使用该基因工程小鼠分析得到的MEFs利用Dox诱导向多潜能干细胞iPSCs转变，并且在不同时间点收集细胞，提取核酸，利用RNA-seq对不同时期的细胞内转录谱变化进行检测，同时，使用replicatemultivar-iate analysis of transcript splicing (rMATS)程序对AS事件进行检测。该分析流程能够对cassette exons(skipped exons ，SEs), alternative 3’和 5’splice sites, retained introns,以及asmutually exclusive exons进行检出,作者团队主要对cassette exons进行了研究。结果显示，如同转录组在不同的transition时期的动态变化一样，基因可变剪接事件可呈现出明显的时空特性，如cluster1和2中includus exon和skipping exon分别呈现梯度增加趋势；cluster3和8则在早期就呈现显著的变化；而cluster4和5中则在第20天向最后的iPSCs过度过程中有着明显的改变。同时，作者使用放射性标记的RT-PCR对不同时期的特异性AS时间进行了验证。

图1：体细胞重编程过程中剪接动态改变的时空分析

2.重编程过程中的可变剪接调控涉及剪接因子复杂的、动态的协同调控

为了寻找不同重编程时期的剪接事件变化与调控剪接相关的因子之间的关联性，作者团队对转录组数据进行了深度分析，特别是对226个与AS有功能相关性的RNA Binding proteins（RBPs）进行了时空表达分析。结果显示95个RBPs可能与这些AS事件存在着相关性。进一步对这95个RBPs进行时空表达的特性分析，得到这些RBPs涉及9种不同 cluster的动态变化。同时，作者还利用Jackknife version Pearson correlation coefﬁcient对AS与RBPs表达进行了相关性分析,发现特异的AS时空调控与RBPs的表达存在着相关性，对于这种相关性，作者进行了实验验证。作者观察到在多能性诱导过程中，Mbnl1和Mbnl2存在进程性的下调，这两个基因都在前期被报道与多能性相关AS调控中发挥功能。在MEFs中敲低或过表达这两个基因后，Ssbp3, Exoc1, Macf1, Tead1,和 Mta1的转录本剪接变化与多能诱导过程中趋势一致。

图2:剪接因子在重编程过程中的复杂、动态的协同调控

为了找到新的与多能干细胞诱导相关的关键剪接因子，作者利用RBP结合motif分析，对AS exon临近剪接序列进行了motif分析，找到Esrp1结合位点在AS exon上游富集，而Mbnl1则在下游富集。Esrp1和Esrp2曾被报道为早期多能性诱导过程中MET期的上皮细胞marker。虽然作者鉴定的SE exon变化cluster中没有与之对应良好的类型，作者进一步对多能诱导过程中MET时期该基因的剪接调控进行了深入研究，结果提示MET期或重编程时期，Esrp1和Esrp2上调促进靶基因的AS变化。

图3：Esrp1调控MET期的AS，并提高重编程能力

3.外源表达Esrp1促进重编程进程

作者在小鼠MEFs中对Esrp1多表达，观察到重编程进程显著提升。受Esrp1调控的一个非常显著的外显子是转录因子Grhl1的第五位外显子。作者将该转录因子的两个转录本均进行了过表达研究，发现长的转录本能够促进重编程，而短转录本则没有这种生理功能，进一步说明Esrp1在重编程过程中通过AS调控影响编程结果。

图4：Esrp1促进Grhl1转录本的表达，提高重编程能力

参考文献

Cieply B, Park JW, et al., Multiphasic and Dynamic Changes in Alternative Splicing during Induction of Pluripotency AreCoordinated by Numerous RNA-Binding Proteins. Cell Rep. 2016. 15(2):247-55.

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