哈工大黄志伟组Cell Research解析高保真Cas9三维结构

PAM兼容性和脱靶效应是阻碍SpCas9系统潜在治疗应用的两大限制。已经报道了几种新的 SpCas9突变体克服上述两大障碍。例如，高保真SPCA9变体SpCas9 - HF1、eSpCas9和HypaCas9是通过SPCA9的DNA相互作用残基的多次突变来制造的，以降低靶DNA识别和切割的能量。最近，噬菌体辅助连续进化( PACE )方法被用于鉴定识别多个PAM序列的几个SpCas9变体。其中一种变体被称为xCas9 3.7 (携带7个点突变，A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I和E1219V，与野生型( WT) SpCas9相比)，在哺乳动物细胞中对5′- NG - 3′、5′- GAA - 3、′和5′- GAT - 3′PAM序列具有最广泛的相容性因此，xCas9 3.7变体代表了高编辑效率、广泛的PAM兼容性和高DNA靶向特异性的集合。然而，xCas9 3.7的PAM识别范围扩大和DNA特异性提高的分子机制仍不清楚。

为了对xCas9 3.7的扩大PAM识别和提高切割保真度的分子机制提供结构见解，哈尔滨工业大学黄志伟课题组以2.7和3.0 å分辨率分别测定了xCas9 3.7与100个核苷酸( nt) sgRNA、28-nt靶DNA链和11-nt非靶DNA链的复合物的晶体结构。

xCas9 3.7和SpCas9之间的结构比较显示，尽管它们的总体结构相似，相对于NUC结构域，REC2和REC3结构域存在显著的构象差异。具体而言，与SpCas9相比，位于REC裂片近端的xCas9 3.7的REC3结构域绕10 å移动远离导向RNA/DNA异源双链体，使RNA/DNA异源双链体溶剂的5’端暴露。xCas9 3.7的REC2结构域也经历了实质性的结构重排。它旋转离开导向RNA/DNA异源双链体和REC1结构域，以稳定REC3结构域的构象。尽管REC2和REC3结构域的构象发生了变化，但它们在PAM末端仍保持相互接触，这意味着xCas9 3.7中的这些构象变化可能在增强DNA靶向特异性方面发挥重要作用。

结构比较表明，盐桥稳定的R1335对于SpCas9严格选择PAM序列至关重要。xCas9 3.7中E1219V突变对该残基的无限制旋转聚合降低了PAM识别的严格性，并允许SpCas9识别多个PAM序列，如生化数据进一步支持的那样。与野生型( WT) SpCas9相比，xCas9 3.7中的REC2和REC3结构域经历了显著的构象变化，导致与DNA底物的接触减少。SpCas9突变体经工程改造后，与DNA的相互作用更少，构象上更灵活的REC2和REC3结构域在生化和细胞分析中显示出对DNA底物更强的特异性。综上所述，发现揭示了xCas9 3.7的PAM相容性拓宽和DNA保真度高的结构机制，这有助于更有效的SpCas9变体和可能的其他Cas9同源蛋白的合理工程设计。