头颈部肿瘤(Head and neckcancer, HNC)作为一种常见的恶性肿瘤,近年来的主要治疗方式包括手术切除、放疗和化疗等,顺铂仍然是最主要的化疗药物。然而,晚期患者手术难以根治,放疗、化疗效果不理想也易产生耐受。因此,理解头颈癌患者化疗耐受的具体机制,提高化疗药物的敏感性,是改善化疗耐受患者预后情况和生活质量的有效措施。
近日,在Genome Biology上发表的“Exosomal miR-196a derived from cancer associatedfibroblasts confers cisplatin resistance in head and neck cancer throughtargeting CDKN1B and ING5”指出,肿瘤相关成纤维细胞分泌的外泌体中的miR-196a能够通过靶向受体头颈癌细胞中的CDKN1B和ING5促进头颈癌细胞的顺铂耐受。在这项研究中,课题组首先从HNC的组织中原代提取了CAFs,并根据纤维细胞标记物:α-SMA、FAP和FSP1,通过细胞荧光和Western blot对CAFs进行了鉴定(Figure 1a-1b)。使用顺铂处理癌旁组织中提取的成纤维细胞NFs、肿瘤相关成纤维细胞CAFs、普通HNC肿瘤细胞如CAL 27、SCC-25、HN4和顺铂耐受的HNC肿瘤细胞HN4-res后,研究人员发现CAFs在顺铂处理下的存活率要显著高于其他细胞,在顺铂处理下的IC50值也要更高一些(Figure 1c-1e)。进一步通过Western blot检测细胞内药物耐受相关蛋白,发现CTR1在CAFs中的表达偏低,而XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1和Bcl-2的表达偏高(Figure 1f-1g)。在进一步的细胞实验中,敲低ERCC1和ERCC4都能够逆转CAFs自身的顺铂耐受作用(Figure S1e-S1f)。
Figure 1
为了探索CAFs对HNC细胞功能的影响,研究人员首先分别将CAFs的条件培养基加入到顺铂相对敏感的CAL 27和HN4细胞中,以各自肿瘤细胞的条件培养基作对照,发现显著增加CAL27和HN4自身的增殖能力以及在顺铂处理下的细胞活力显著增加(Figure 2a-2b)。然而,使用超速离心的方式离去条件培养基中的外泌体或者通过GW4869处理抑制CAFs外泌体分泌后获取的条件培养基继续培养CAL27或HN4细胞后,增殖活力和顺铂耐受都远不及CAFs的正常条件培养基处理后的细胞(Figure 2c-2d)。超速离心获取CAFs细胞的条件培养基中的外泌体后,WB检测了外泌体表面蛋白Alix,HSP90, HSP70, CD63, CD9, Rab5以及GRP94的表达,电镜和nanosight粒径分析验证外泌体的提取(Figure 2e)。有意思的是,顺铂处理后,NFs、CAFs以及HNC细胞中外泌体的分泌显著增加(Figure 2f-2g)。使用DIO标记外泌体后,验证了外泌体被肿瘤细胞受体吸收的过程,并且顺铂处理后的CAFs的外泌体相比未经顺铂处理的CAFs的外泌体以及HN4-res外泌体,更能够促进CAL27和HN4细胞的增殖(Figure 2h-2k)。
Figure 2
MiRNA芯片分析检测了NFs和CAFs分泌的外泌体中的差异miRNA表达,并通过RT-qPCR锁定了miR-196a在不同细胞中以及不同处理的条件培养基中的差异表达(Figure 3a-3c)。使用Cy3标记miR-196a后的荧光检测,进一步的Rnase A与Triton X-100的联合处理,以及检测超速离心前后的CAF条件培养基、外泌体中的miR-196a表达,都验证了miR-196a从CAFs的外泌体向HNC细胞中转移的过程(Figure 3d-3f)。接下来研究人员通过转染调控CAF中miR-196a的表达,获取了不同表达miR-196a的CAFs的外泌体,分别处理CAL27和HN4后,发现CAFs中的miR-196a表达能够影响到肿瘤细胞受体中miR-196a的表达,并且高表达miR-196a的CAFs分泌的外泌体更能够促进CAL27和HN4的增殖能力和顺铂耐受(Figure 3g-3j)。
Figure 3
接下来研究人员预测了对miR-196a在CAFs中的表达具有内源性调控的因子,最终验证了hnRNPA1能够靶向结合miR-196a并正向调节CAFs细胞中以及外泌体中miR-196a的表达水平(Figure 4a-4h)。过表达hnRNPA1的CAFs与CAL27共同注射进裸鼠后,成瘤体积增长、淋巴转移情况、肿瘤等级以及化疗耐受要比对照组hnRNPA1显著增加,反之亦然(Figure 4i-4j)。在临床样本中,hnRNPA1在肿瘤组织中的表达也要显著高于癌旁组织,并且与miR-196a的表达正相关(Figure 4k-4l)。
Figure 4
Figure 5
为了研究miR-196a表达对HNC细胞功能的影响,研究人员在CAL-27和HN4细胞中分别过表达和敲除了miR-196a,发现过表达miR-196a能够促进细胞增殖、提高细胞活力、增强细胞的顺铂耐受、促进细胞分裂,而抑制miR-196a后细胞增殖分裂受到抑制并且对顺铂处理更加敏感(Figure 5)。通过收集头颈癌患者临床病理资料和相关样本,研究人员发现miR-196a在人肿瘤组织中的表达与肿瘤体积、淋巴结转移、TNM分级、化疗耐受情况以及患者的预后显著相关(Figure 8c-8e)。分离不同人群的血浆中外泌体,并检测外泌体中miR-196a的表达,发现肿瘤患者血清外泌体中的miR-196a相比正常人的要高,切除手术前的要比切除手术后的高,化疗效果差的要比化疗效果好的高(Figure 8f-8h)。并且血清外泌体中miR-196a高表达的头颈癌患者的预后更差,ROC分析提供了使用血清外泌体中miR-196a表达水平进行化疗效果预判的重要依据(Figure 8i-8j)。在动物实验中,CAFs细胞与CAL27细胞共同注射裸鼠后,成瘤能力和肿瘤生长情况要显著高于CAL27单种细胞的体内成瘤,而用GW448抑制CAFs细胞外泌体分泌后,能够削弱CAFs对CAL27成瘤能力的促进作用(Figure 8a)。而过表达miR-196a的CAFs细胞促CAL 27成瘤和肿瘤生长的能力更强,低表达miR-196a的CAFs细胞则相对正常CAFs细胞能力稍弱(Figure 8b)。
Figure 6
Figure 7
Figure 8
通过筛选miR-196a的靶标基因,以及检测受miR-196a表达调控的基因,课题组发现了在头颈癌组织中与miR-196a表达有负相关的,在CAL27和HN4细胞中受miR-196a负向调控的两个基因CDKN1B和ING5(Figure6a-6e)。在临床组织样本当中,CDKN1B和ING5的表达与肿瘤体积、淋巴结转移情况、TNM分级、化疗耐受以及患者的预后都有关系。双荧光素酶报告实验和boitin-labeled RNA pulldown实验进一步验证了miR-196a和CDKN1B以及ING5的靶向关系(Figure 6f-6k)。Westernblot实验验证了miR-196a和CAF外泌体对CAL27和HN4细胞中p27以及ING5蛋白表达的抑制作用(Figure 6l)。回复实验中,通过同时过表达HNC细胞中miR-196a和ING5,验证了miR-196a通过靶向抑制ING5促进细胞的顺铂耐受(Figure 6m)。在更下游的机制探索中,研究人员发现,CDKN1B能进一步影响下游P27、CDK2、CDK4、cyclin D1和cyclin E1的表达,而ING5能够影响顺铂处理下细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved PPAR的表达,并且CDKN1B和ING5之间的表达互不影响(Figure 7a-7c)。回复实验中进一步验证了miR-196a通过影响CDKN1B和ING5的表达影响细胞在顺铂作用下的耐受(Figure 7d-7g)。
研究人员总体阐述了肿瘤相关成纤维细胞在hnRNPA1过表达时促进了miR-196a在分泌外泌体中的表达,进而提高了受体头颈癌肿瘤细胞中miR-196a的表达。外源性miR-196a在头颈癌肿瘤细胞中通过靶向抑制CDKN1B和ING5增强了细胞的活力并提高了细胞的顺铂耐受(Figure 8k)。在整体机制的探索中,该项研究的思路清晰,论证严谨,是外泌体的研究当中非常值得学习的一份研究。
参考文献
Xing Qin, Haiyan Guo, Xiaoning, et al. WangExosomal miR-196a derivedfrom cancer associated fibroblasts confers cisplatin resistance in head andneck cancer through targeting CDKN1B and ING5. Genome Biology. 2019:20:12. https://doi.org/10.1186/s13059-018-1604-0
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