头颈部肿瘤（Head and neckcancer, HNC）作为一种常见的恶性肿瘤，近年来的主要治疗方式包括手术切除、放疗和化疗等，顺铂仍然是最主要的化疗药物。然而，晚期患者手术难以根治，放疗、化疗效果不理想也易产生耐受。因此，理解头颈癌患者化疗耐受的具体机制，提高化疗药物的敏感性，是改善化疗耐受患者预后情况和生活质量的有效措施。
近日，在Genome Biology上发表的“Exosomal miR-196a derived from cancer associatedfibroblasts confers cisplatin resistance in head and neck cancer throughtargeting CDKN1B and ING5”指出，肿瘤相关成纤维细胞分泌的外泌体中的miR-196a能够通过靶向受体头颈癌细胞中的CDKN1B和ING5促进头颈癌细胞的顺铂耐受。在这项研究中，课题组首先从HNC的组织中原代提取了CAFs，并根据纤维细胞标记物：α-SMA、FAP和FSP1，通过细胞荧光和Western blot对CAFs进行了鉴定（Figure 1a-1b）。使用顺铂处理癌旁组织中提取的成纤维细胞NFs、肿瘤相关成纤维细胞CAFs、普通HNC肿瘤细胞如CAL 27、SCC-25、HN4和顺铂耐受的HNC肿瘤细胞HN4-res后，研究人员发现CAFs在顺铂处理下的存活率要显著高于其他细胞，在顺铂处理下的IC50值也要更高一些（Figure 1c-1e）。进一步通过Western blot检测细胞内药物耐受相关蛋白，发现CTR1在CAFs中的表达偏低，而XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1和Bcl-2的表达偏高（Figure 1f-1g）。在进一步的细胞实验中，敲低ERCC1和ERCC4都能够逆转CAFs自身的顺铂耐受作用（Figure S1e-S1f）。
Figure 1
Figure S1
为了探索CAFs对HNC细胞功能的影响，研究人员首先分别将CAFs的条件培养基加入到顺铂相对敏感的CAL 27和HN4细胞中，以各自肿瘤细胞的条件培养基作对照，发现显著增加CAL27和HN4自身的增殖能力以及在顺铂处理下的细胞活力显著增加（Figure 2a-2b）。然而，使用超速离心的方式离去条件培养基中的外泌体或者通过GW4869处理抑制CAFs外泌体分泌后获取的条件培养基继续培养CAL27或HN4细胞后，增殖活力和顺铂耐受都远不及CAFs的正常条件培养基处理后的细胞（Figure 2c-2d）。超速离心获取CAFs细胞的条件培养基中的外泌体后，WB检测了外泌体表面蛋白Alix，HSP90, HSP70, CD63, CD9, Rab5以及GRP94的表达，电镜和nanosight粒径分析验证外泌体的提取（Figure 2e）。有意思的是，顺铂处理后，NFs、CAFs以及HNC细胞中外泌体的分泌显著增加（Figure 2f-2g）。使用DIO标记外泌体后，验证了外泌体被肿瘤细胞受体吸收的过程，并且顺铂处理后的CAFs的外泌体相比未经顺铂处理的CAFs的外泌体以及HN4-res外泌体，更能够促进CAL27和HN4细胞的增殖（Figure 2h-2k）。
Figure 2
MiRNA芯片分析检测了NFs和CAFs分泌的外泌体中的差异miRNA表达，并通过RT-qPCR锁定了miR-196a在不同细胞中以及不同处理的条件培养基中的差异表达（Figure 3a-3c）。使用Cy3标记miR-196a后的荧光检测，进一步的Rnase A与Triton X-100的联合处理，以及检测超速离心前后的CAF条件培养基、外泌体中的miR-196a表达，都验证了miR-196a从CAFs的外泌体向HNC细胞中转移的过程（Figure 3d-3f）。接下来研究人员通过转染调控CAF中miR-196a的表达，获取了不同表达miR-196a的CAFs的外泌体，分别处理CAL27和HN4后，发现CAFs中的miR-196a表达能够影响到肿瘤细胞受体中miR-196a的表达，并且高表达miR-196a的CAFs分泌的外泌体更能够促进CAL27和HN4的增殖能力和顺铂耐受（Figure 3g-3j）。
Figure 3
接下来研究人员预测了对miR-196a在CAFs中的表达具有内源性调控的因子，最终验证了hnRNPA1能够靶向结合miR-196a并正向调节CAFs细胞中以及外泌体中miR-196a的表达水平（Figure 4a-4h）。过表达hnRNPA1的CAFs与CAL27共同注射进裸鼠后，成瘤体积增长、淋巴转移情况、肿瘤等级以及化疗耐受要比对照组hnRNPA1显著增加，反之亦然（Figure 4i-4j）。在临床样本中，hnRNPA1在肿瘤组织中的表达也要显著高于癌旁组织，并且与miR-196a的表达正相关（Figure 4k-4l）。
Figure 4
Figure 5
为了研究miR-196a表达对HNC细胞功能的影响，研究人员在CAL-27和HN4细胞中分别过表达和敲除了miR-196a，发现过表达miR-196a能够促进细胞增殖、提高细胞活力、增强细胞的顺铂耐受、促进细胞分裂，而抑制miR-196a后细胞增殖分裂受到抑制并且对顺铂处理更加敏感（Figure 5）。通过收集头颈癌患者临床病理资料和相关样本，研究人员发现miR-196a在人肿瘤组织中的表达与肿瘤体积、淋巴结转移、TNM分级、化疗耐受情况以及患者的预后显著相关（Figure 8c-8e）。分离不同人群的血浆中外泌体，并检测外泌体中miR-196a的表达，发现肿瘤患者血清外泌体中的miR-196a相比正常人的要高，切除手术前的要比切除手术后的高，化疗效果差的要比化疗效果好的高（Figure 8f-8h）。并且血清外泌体中miR-196a高表达的头颈癌患者的预后更差，ROC分析提供了使用血清外泌体中miR-196a表达水平进行化疗效果预判的重要依据（Figure 8i-8j）。在动物实验中，CAFs细胞与CAL27细胞共同注射裸鼠后，成瘤能力和肿瘤生长情况要显著高于CAL27单种细胞的体内成瘤，而用GW448抑制CAFs细胞外泌体分泌后，能够削弱CAFs对CAL27成瘤能力的促进作用（Figure 8a）。而过表达miR-196a的CAFs细胞促CAL 27成瘤和肿瘤生长的能力更强，低表达miR-196a的CAFs细胞则相对正常CAFs细胞能力稍弱（Figure 8b）。
Figure 6
Figure 7
Figure 8
通过筛选miR-196a的靶标基因，以及检测受miR-196a表达调控的基因，课题组发现了在头颈癌组织中与miR-196a表达有负相关的，在CAL27和HN4细胞中受miR-196a负向调控的两个基因CDKN1B和ING5（Figure6a-6e）。在临床组织样本当中，CDKN1B和ING5的表达与肿瘤体积、淋巴结转移情况、TNM分级、化疗耐受以及患者的预后都有关系。双荧光素酶报告实验和boitin-labeled RNA pulldown实验进一步验证了miR-196a和CDKN1B以及ING5的靶向关系（Figure 6f-6k）。Westernblot实验验证了miR-196a和CAF外泌体对CAL27和HN4细胞中p27以及ING5蛋白表达的抑制作用（Figure 6l）。回复实验中，通过同时过表达HNC细胞中miR-196a和ING5，验证了miR-196a通过靶向抑制ING5促进细胞的顺铂耐受（Figure 6m）。在更下游的机制探索中，研究人员发现，CDKN1B能进一步影响下游P27、CDK2、CDK4、cyclin D1和cyclin E1的表达，而ING5能够影响顺铂处理下细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved PPAR的表达，并且CDKN1B和ING5之间的表达互不影响（Figure 7a-7c）。回复实验中进一步验证了miR-196a通过影响CDKN1B和ING5的表达影响细胞在顺铂作用下的耐受（Figure 7d-7g）。
研究人员总体阐述了肿瘤相关成纤维细胞在hnRNPA1过表达时促进了miR-196a在分泌外泌体中的表达，进而提高了受体头颈癌肿瘤细胞中miR-196a的表达。外源性miR-196a在头颈癌肿瘤细胞中通过靶向抑制CDKN1B和ING5增强了细胞的活力并提高了细胞的顺铂耐受（Figure 8k）。在整体机制的探索中，该项研究的思路清晰，论证严谨，是外泌体的研究当中非常值得学习的一份研究。
参考文献
Xing Qin, Haiyan Guo, Xiaoning, et al. WangExosomal miR-196a derivedfrom cancer associated fibroblasts confers cisplatin resistance in head andneck cancer through targeting CDKN1B and ING5. Genome Biology. 2019:20:12. https://doi.org/10.1186/s13059-018-1604-0
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