唐家澍
前言
胰岛素是人体内调控血糖稳态最重要的激素之一，胰岛素的绝对或相对缺乏是最终导致糖尿病的最重要因素。临床上一般通过测量空腹血糖，糖耐量和糖化血红蛋白来进行糖尿病的诊断，并通过胰岛素和C肽的释放实验来评估胰岛功能，从而选择合适的降糖药物。胰岛素是历史最为悠久的生物药之一，从上世纪80年代开始，各制药公司开始生产各种胰岛素类似物，以满足不同的药代动力学需求，例如速效胰岛素类似物门冬胰岛素（insulin aspart）和长效胰岛素类似物甘精胰岛素(insulin glargine)等。
成熟的胰岛素通过切除C肽形成A, B两条链，通过两对链间二硫键保持二级结构。胰岛素的治疗类似物都是通过对个别氨基酸进行替换，或者加上一些翻译后修饰来实现（图1），从而使得不同的治疗类似物在体内体现出不同的代谢速率。在临床上，将內源胰岛素和治疗胰岛素区分检测，对于胰岛功能评估和药物浓度监控具有非常重要的意义。
图1. 內源胰岛素和胰岛素治疗类似物的序列结构
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胰岛素的临床检测
对于血清胰岛素的定量以往主要采用免疫法，但采用免疫法检测胰岛素也存在着以下不足。
第一，目前各厂家商业化的免疫试剂盒并未向国际标准物质进行溯源，导致各厂家检测的同一样本可能存在两倍的偏差[1]。
第二，病人血清中自抗体和异嗜性抗体的存在也会干扰免疫法的定量结果。
第三，由于胰岛素类似物药物和內源胰岛素的序列高度相似，不同厂家的免疫试剂盒对于胰岛素类似物的区分能力各不相同，极大的影响了血清中內源胰岛素和胰岛素治疗类似物的定量。
胰岛素由于两对链间二硫键的存在，使得只有B链的C端能够部分碎裂。如內源胰岛素产生的主要碎片离子是B链的 (y3-y1)+和y3+ (图2), 这两个离子在实际血清样品中并不能提供足够的特异性。
图2. 胰岛素序列信息和二级质谱图
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并且空腹血清胰岛素含量极低（0.1ng – 1.0ng/mL）, 灵敏度和特异性的双重要求使得用三重四极杆质谱仪来进行血清中胰岛素的定量变的极为挑战。而Thermo则推出了一种全自动化免疫富集结合高分辨质谱检测的解决方案（Mass Spec Immuno-Assay，MSIA），利用免疫富集提供检测灵敏度，利用高分辨质谱提供检测特异性[2]。
全自动化的样品前处理
MSIA方法的样品前处理极为方便，只需要通过自动液体处理平台进行免疫富集即可。在MSIA方法中，胰岛素的抗体被共价交联在树脂上，随后该树脂被填装在D.A.R.T吸头中，形成了商品化的MSIA™ insulin D.A.R.T富集吸头（图3）。
图3. MSIA™ insulin D.A.R.T的工作原理
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该吸头中使用的胰岛素抗体针对內源胰岛素和治疗类似物的共有序列，因此可将內源胰岛素和所有市售治疗类似物进行富集。
整个样品操作过程仅需四步：
1) 加入内标缓冲液;
2) 样品孵育，免疫富集;
3) 清洗;
4) 胰岛素洗脱。
洗脱液加水稀释后便可直接进行质谱分析。而整个样品前处理过程可通过12通道或者96通道的自动液体处理平台进行无人值守的全自动操作（图4）。
图4. Insulin MSIATM的全流程自动化解决方案
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由于在整个过程中无任何体积的损失（相比于蛋白沉淀和固相萃取），因此获得了将近100%的绝对回收率。且最后的洗脱液体积非常小（<>
Q Exactive丰富的定量模式
轻松区分不同治疗类似物
Q Exactive系列质谱仪提供了多种定量模式，包括采用Full Scan或者SIM scan来针对母离子进行定量，或者通过PRM来针对碎片离子进行高分辨的二级定量。门冬，谷赖，甘精，地特胰岛素和內源胰岛素之间均存在一定的质量差，依赖于Orbitrap的超高分辨率，在一级质谱上可以进行非常轻松的区分（图5）。
图5. 采用Full Scan分析胰岛素治疗类似物
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采用Full Scan进行检测方法开发最为简单，定量任何类似物均采用相同的质谱方法，并且在定量能力上也达到了预期（图6）。而SIM scan的每一个Scan event都针对特定的某一治疗类似物，通量低于full scan, 但在定量性能上则得到了显著的提升（图6）。
图6. 采用Full scan 或者SIM Scan定量胰岛素治疗类似物的线性范围（点击查看大图）
在定量胰岛素治疗类似物时，谷赖胰岛素最具挑战，谷赖胰岛素和人內源胰岛素之间只是B链的28和29位的氨基酸互换了位置（图7A）。它们具有相同的分子量，仅有一个B链的低分子量的碎片可区分二者（图7B）。QE系列仪器上的PRM（Parallel Reaction Monitoring）是一种高分辨的靶向二级定量模式，比传统三重四极杆质谱仪的SRM模式提供了更高的选择性。针对谷赖胰岛素，我们可见采用MSIA方法进行样品前处理并采用PRM模式进行数据采集，可轻松达到7.7pmol/L的定量下限（图7C）。
图7. 用PRM模式对內源胰岛素和谷赖胰岛素进行定量（点击查看大图）
对肽段定量时，选用低分子量碎片往往使得方法的特异性不够，容易被其他共流出肽段干扰，因此对样品前处理提出了更高的要求。采用MSIA方法可以获得比传统磁珠富集更好的特异性，减少非特异性吸附，在进行实际样品分析时未见对內源和谷赖胰岛素的定量干扰。
适合完整大分子定量的色谱柱
对于胰岛素这类分子量比较大的肽段，选择合适的色谱条件尤为重要。色谱填料孔径过小可能导致蛋白质直接流穿，无法和键合相结合。在进行微量样品分析时，不合适的材质会导致蛋白的非特异性吸附，从而影响色谱峰型，甚至导致无法检测到被分析物。普通硅胶柱分析胰岛素时产生了明显的拖尾，并且在50针进样后色谱峰型变得非常差（图8A）。
ProSwift RP-4H是一种苯基性质的整体柱，并且柱套采用了生物兼容的PEEK材质，由于整体柱背压非常低，所以采用PEEK材质不会因为耐压不够而无法使用高流速分析。采用ProSwift RP-4H分析胰岛素取得非常好的色谱峰型，峰宽在6s左右，完全没有拖尾。并且在100针后还保持完全一致的峰型和保留时间（图8B）。
图8. 用ProSwift RP-4H色谱柱检测胰岛素的色谱表现（点击查看大图）
结论
采用ThermoFisher专利的MSIA®方法进行免疫富集结合QE系列质谱可对血清中的內源胰岛素进行高灵敏度，高特异性的同时检测。QE系列质谱仪上丰富的定量模式使得最为挑战的谷赖胰岛素的检测也取得了非常好的效果。在整个流程中，MSIA免疫富集为检测提供了高灵敏度，而Orbitrap超高分辨质谱为检测提供了高特异性。若将整个系统中的液相色谱替换成ThermoFisher的Transcend II LX-4四通道液相（图9），则可将检测通量提升四倍，实现2分钟一个样品中所有胰岛素类似物的同时检测。
图9. Transcend II LX-4四通道液相色谱示意
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参考文献
1. Manley, S.E., et al., Comparison of 11 human insulin assays: implications for clinical investigation and research. Clin Chem, 2007. 53(5): p. 922-32.
2.Peterman, S., et al., An automated, high-throughput method for targeted quantification of intact insulin and its therapeutic analogs in human serum or plasma coupling mass spectrometric immunoassay with high resolution and accurate mass detection (MSIA-HR/AM). Proteomics, 2014. 14(12): p. 1445-56.
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