ELISA即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题，我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表：
问题一：高背景或阴性对照值偏高
可能原因
建议
阴性对照孔被阳性对照或样品污染
洗涤时，勿将洗液溢出孔外
抗体非特异性结合
封闭液不适合，更换封闭液
酶结合物过浓
请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
孵育温度过高
检查孵育箱的温度是否正确、稳定
底物在使用前曝光
应保存在暗处，避光
读板前停留时间过长
加终止液后3分钟内读数
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
可能原因
建议
试剂未平衡至室温
实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温
检测体积偏小
检查移液器吸液管道是否堵塞
孵育时间过短
使用计时器，准确孵育时间
底物受污染
使用新配置的试剂，重新实验
包装袋中有湿气
检查袋中是否有干燥剂
样本中有抑制剂
叠氮钠会抑制HRP酶的活性
问题三：边缘效应
可能原因
建议
蒸发
各步之间，须使用封版胶密封反应板
温度不均匀
校准孵育箱，勿叠放反应板
问题四：标准曲线不佳
可能原因
建议
倍比稀释标准品时未混匀
稀释标准品的每一步均需混匀
过早稀释
标准品在快要使用时稀释
加入的体积不正确
使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中
问题五：标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因
建议
样本中无检测物或检测物含量极低
设置内参，重新实验
样本中其他物质影响/掩盖检测
作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率
样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值
适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内
问题六：重复性较差
可能原因
建议
微孔中有气泡
用针尖挑破气泡
试剂未混匀
确保充分混匀试剂
样本中有杂质或沉淀物
使用前离心
微孔包被面被吸头划破
加液时小心操作
使用用过的封板胶纸
每次须使用新的封板胶封住反应孔
问题七：假阳性反应
可能原因
建议
洗涤不充分
使用前需检查洗板机是否正常工作
洗板机管道堵塞
需经常维护洗板机
加结合物时，洒在微孔边缘
小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
检测样本中含有红细胞
离心
微孔中液体挥发
用封板胶密封反应孔，置于湿盒内
问题八：整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色
可能原因
建议
洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染
洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外
结合物浓度过高
检查是否按照说明书推荐比例稀释
血清中有血清因子
勿加热血清
底物容器不洁净
用酸清洗容器瓶，用蒸馏水冲洗
底物孵育时，微孔板曝光
加底物时，立即将板置于暗处
问题九：整块板OD值偏低
可能原因
建议
显色时间不足
适当延长显色时间
孵育温度偏低
36度为最适反应温度（欣博盛ELISA试剂盒）
未加终止液
加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应
问题十：显色缓慢
可能原因
建议
样本未置于室温
实验开始前，将样本平衡至室温
酶结合物活性减弱
检测稀释度
酶活性收到抑制如叠氮钠
避免实验不当的防腐剂
显色温度不适当
按说明书操作
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