前言
胆管炎是影响胆管细胞的疾病，胆管细胞是胆道内的细胞。肝干细胞（LSCs）能够分化成肝脏的所有细胞，并可能通过分泌信号分子影响周围的肝脏组织。细胞可以相互作用的一种方式是通过分泌细胞外囊泡（EV），其是含有蛋白质，miRNA和细胞因子的小膜结合囊泡。2月5日美国中部德克萨斯退伍军人医疗保健系统在HEPATOLOGY上发表了文章“Amelioration of Ductular Reaction by Stem Cell Derived Extracellular Vesicles in MDR2 knockout mice via let-7 microRNA”，文章评估了肝干细胞衍生的EV（LSCEV）的含量，将它们的miRNA含量与从肝细胞分离的EV的那些进行了比较，并评估了这些miRNA的下游靶标。最终评估了LSCs，胆管细胞和HSC之间的串扰。
文章发现LSCEVs能够减少MDR2-/-小鼠的导管反应和胆汁纤维化。此外，文章发现在LSCEV处理的小鼠中胆管细胞生长减少并且HSC失活。与源自肝细胞的EV相比，LSCEV含量的评估显示miRNA，let-7的大量增加。对MDR2-/-小鼠和人PSC样品中let-7的进一步评估显示，与对照相比，let-7水平降低。在肝脏组织和分离的胆管细胞中，let-7的下游靶标（通过独创性途径分析鉴定），Lin28a，Lin28b，IL-13，NR1H4和NF-κB在MDR2-/-小鼠中升高，但用LSCEVs处理降低了这些介导的反应和胆汁纤维化的介质通过抑制NF-κB和IL-13信号通路。使用来自LSCEV处理的细胞的胆管细胞上清液对培养的HSC的串扰评估显示HSC具有降低的纤维化水平和增加的衰老。总体而言，研究表明LSCEV可能是胆管病的可能治疗方法，或LSCEVs可用于未来治疗的靶标验证。
研究思路
Figure 1:肝干细胞，肝干细胞衍生的细胞外囊泡的特征。A.免疫细胞化学用于检测培养的肝干细胞中肝脏祖细胞标记物，CK-18，EpCam和甲胎蛋白的存在。B.TEM用于成像分泌EV的肝干细胞。C.在LSCEV分离后，使用NanoSight仪器测量分离的EV大小和制剂的丰度。D＆E.在人H69胆管细胞系中掺入LSCEV。用PKH26绿色染料标记的EV或用sHA预孵育的H69细胞内化的代表性显微照片;或用阻断抗CD44的单克隆抗体。通过使用六个随机选择区域的显微照片的NIH Image J软件分析来测量PKH26绿色染料的荧光强度。
Figure 2:LSC衍生的细胞外囊泡对人胆管细胞的增殖，凋亡和纤维化作用的调节。A：使用BrdU细胞增殖测定试剂盒,并将MBrdU加入到4000个细胞/孔中到96孔板中，在存在于FEM中的DMEM中孵育。B：LSC-EV治疗还阻断LPS诱导的胆管细胞增殖。 C：通过与LSC-EV孵育24或48小时的H69细胞释放SCF和 GM-CSF与之孵育的H69细胞相比HH-EV。D：通过TUNEL测定评估TNFα刺激后凋亡细胞的百分比。 E：LSC-EV对H69胆管细胞中TGFβ诱导的纤维化标志物α-SMA的影响。F：LSC-EV对TGFβ的作用抑制HSC的衰老。
Figure 3:用LSCEV治疗的MDR2-/-小鼠的炎症和纤维化分析。 A.用LSCEV或载体（PBS）处理MDR2 -/-小鼠，并与WT小鼠比较。用H＆E染色评估来自小鼠的肝组织样品以评估肝脏的结构解剖结构。B.肝组织切片用天狼星红（胶原标记物）染色。 C.天狼星红染色通过用ImageJ软件将红色染色的面积除以总面积来量化。 D.在分离的胆管细胞中进行qPCR的纤维化标记物，Col1A1和肌动蛋白，ACTA2标准化为WT表达。
Figure 4:胆管细胞增殖的评估和与其他细胞类型的相互作用。A.来自WT，MDR2-/-和MDR2-/- + LSCEV的肝组织切片用细胞角蛋白-19（CK-19）（胆管细胞的标记物）染色，以评估胆管质量。B＆C.当通过双染色免疫组织化学分析与WT对照比较时，在MDR2-/-小鼠肝脏中检测到巨噬细胞浸润和导管反应区域周围的肝纤维化。D.用qPCR测量增殖标志物PCNA和Ki-67的胆管细胞增殖。 E.通过qPCR测量衰老标记物p16和p21的总肝衰老。
Figure 5:LSCEV内容和下游途径的识别。A.为了鉴定LSCEV的miRNA含量，使用凋亡microRNA qPCR阵列来评估与HHEV相比的miRNA水平。B＆C.为了评估let-7的下游靶标，对于Lin28A和Lin28B，在总肝脏和分离的胆管细胞中评估了Lin28。D.在免疫组织化学的肝切片中测量了FoxA2，修复的标记和let-7途径的下游靶标。E＆F.用总肝（E）和分离的胆管细胞（F）中的qPCR测量FoxA2表达水平。
Figure 6:在LSCEV处理的H69细胞和MDR2-/-小鼠肝脏中let-7相关的抗炎和抗纤维化信号传导机制。A：基于LSEC的Ingenuity途径分析在MDR2-/-小鼠和miRNA PCR阵列发现中显示let-7可以靶向IL-13 / NR1H4 / NF-κB并随后改变导管反应/炎症/纤维化信号传导途径。B：pre-miRNA对照，在LPS刺激后，pre-let-7a转染的H69人胆管细胞中NF-κB信号传导途径的关键介质的表达水平发生改变。 C：通过 LCM从对照和LSCEV处理的MDR2-/-小鼠肝切片中的管状反应场收集的CK19阳性细胞中分离总RNA。D：与健康对照相比，通过激光捕获显微切割从来自PSC患者的肝切片的导管反应区域分离的胆管细胞收集总RNA。E：在LSCEV治疗的MDR2 -/-小鼠肝脏中使用胆管细胞特异性标记物CK19加磷酸盐或总IkBα抗体的双染色免疫组织化学分析在导管反应区域中检测到IkBα的磷酸化和IkBα的降解。F：通过双染色免疫组织化学分析，与MDR2 -/-和WT对照相比，在LSCEV处理的MDR2 -/-小鼠肝脏中检测到IL-13表达和NF-κB核转位的肺管反应区域。
Figure 7:Let-7 / LSCEV介导的胆管细胞和人巨噬细胞/人肝星状细胞之间的抗炎和抗纤维化相互作用。A和B. Pre-let-7a处理抑制TGFβ刺激的胆管细胞并抑制THP-1细胞的迁移。 A：Pre-let-7a对H69人胆管细胞中炎症/纤维化标志物mRNA表达的影响。B：Pre-let-7a对蛋白质水平的细胞因子IL-13表达的影响。C：来自Pre-let-7a转染的H69细胞的条件培养基抑制人单核细胞系THP-1和人肝星状细胞的迁移。D＆E：为了评估肝干细胞，胆管细胞和HSC之间的相互作用，将H69人胆管细胞与LSCEV孵育，然后将培养基更换为新培养基。移除H69培养基并用于处理星状细胞。然后将星状细胞用于提取mRNA并对纤维化标记物ACTA2（D）和衰老标记物p16（E）进行qPCR。
Figure 8:含有let-7和胆管细胞的LSCEV与随后的管状反应和肝纤维化抑制之间的相互作用的总结。 肝干细胞释放由胆管细胞接收的LSCEV，其导致胆管细胞中let-7增加。这允许let-7抑制Lin28并影响IL-13和NF-κB，这减少了导管反应。Let-7和IL-13也能够影响降低肝纤维化的NR1H4和FoxA2的水平。
结论
肝脏中有几个假定的干细胞群。肝干细胞（卵圆细胞）位于Hering的运河中，能够分化成成熟的胆管细胞或肝细胞。胆管干/祖细胞被认为位于小胆管细胞群以及胆管周围腺体中。先前已经表明，用位于小胆管细胞群中的祖细胞治疗能够通过激活FoxA2来改善胆管结扎所造成的损伤。此外，驻留在小胆管细胞群中的胆管祖细胞能够通过减少纤维化标志物和增加衰老来使HSC失活。有趣的是，来自这些小鼠的分离的小胆管细胞的上清液（最可能含有EV）能够抑制纤维化标志物并增强培养的星状细胞中的衰老标志物，这表明在肝脏修复期间胆管细胞和星状细胞之间的串扰是可能的。
在研究本研究中LSCEV的作用时，认为作为初始损伤目标的胆管细胞将成为LSCEV的目标是合乎逻辑的。因为LSCEV通过尾静脉注射并且很可能在胆管细胞之前通过HSC，所以它们能够影响HSC并不奇怪。然而，胆管细胞很可能在它们与LSCEV相互作用后分泌它们自己的EV以影响HSC。在本研究中通过用LSCEV处理的IMCL上清液处理培养物中的HSC进行了最终实验，HSC中纤维化的减少和衰老的增加清楚地表明这种相互作用是可能的。
总之，已经证明LSCEV能够通过let-7依赖性减少Lin28a，Lin28b，IL-13，NF-κB，NR1H4和FoxA2的增强来减少MDR2 -/-小鼠的导管反应和胆汁纤维化。总体而言，可以进一步研究LSCEV治疗以验证let-7作为靶标或使用LSCEV本身作为胆汁淤积性肝病的治疗。
全文链接
https://pan.baidu.com/s/1bMJgKb5XsYzsv4NUo9TbNg
EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。
联系客服
