Nat Commun | 蛋白质组学揭示癌症外泌体抑制抗肿瘤免疫反应

景杰生物/报道 

编者按：外泌体是大小30-150nm的细胞外囊泡，包含大量DNA，RNA和蛋白质，并在免疫反应中起重要作用。在大多数肿瘤类型中，B细胞通过产生针对肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）的自身抗体参与相关的自身免疫反应。自身抗体的产生可能先于疾病症状数月或数年，因此，检测循环中的肿瘤相关自身抗体是一种可行的癌症早期检测方法。肿瘤衍生的外泌体中含有大量的TAA，但是TAA被免疫系统识别从而引发免疫反应的过程还没有被研究清楚。

蛋白质组学是外泌体功能研究的有利工具。近日，美国MD Anderson癌症中心的Samir M. Hanash教授团队发表在国际专业学术期刊Nature Communications上的文章，运用蛋白质组学技术研究了肿瘤相关外泌体的蛋白质组学特征。

研究发现肿瘤外泌体的膜表面具有作为自身抗体靶标的大量TAAs库，证明了肿瘤来源的外泌体与血浆中的循环免疫球蛋白结合，发挥诱饵功能减弱针对肿瘤细胞的补体介导的细胞毒性。

研究精读

1. 结合循环免疫球蛋白的蛋白质组学分析

本文选择来自PDAC患者血浆样本的免疫复合物为研究样本，进行了深入的蛋白组学分析。研究人员采用亲和捕获法从血浆中分离循环免疫球蛋白(Igs)，液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)鉴定Igs结合蛋白(图1a)。使用PDAC患者的血浆样本池进行分析，并与匹配的健康受试者、良性胰腺囊肿患者和慢性胰腺炎患者的血浆样本池进行比较(图1b)。

图1 结合循环免疫球蛋白的蛋白质组学分析

研究共鉴定出308个Ig结合蛋白质，挑选了92个蛋白质，其中59个在PDAC中显著超表达。Meta Core基因本体定位分析表明这92个Ig结合蛋白显著富集在胞外囊泡、外泌体和核内体相关蛋白上（图2）。 Ig结合蛋白在外泌体相关蛋白中富集的发现提示外泌体在胰腺导管腺癌（PDAC）患者血浆中与免疫球蛋白结合。

图2 Ig结合蛋白在外泌体相关蛋白中富集

2. PDAC细胞系外泌体的蛋白质组学分析

接下来，研究者检测在PDAC患者中诱导自身抗体的抗原蛋白是否在PDAC细胞系的外泌体表面富集。 运用定量蛋白质组学技术对6个人PDAC细胞系(CFPAC-1、hpa - ii、SU.86.86、Panc 03.27、MIA PaCa-2、pan -1)和从这些细胞系的条件培养基中分离的外泌体进行研究分析。细胞和外泌体表面蛋白被生物素标记，并通过与单体亲和捕获（图3a）。

研究共鉴定了4125个蛋白质, 相对于它们各自的细胞系蛋白组，外泌体分离物在先前描述的外泌体相关蛋白(CD81、CD9、FLOT1、FLOT2、PDCD6IP、SDCBP和TSG101)中表现出富集，而缺乏外泌体中高表达的内体蛋白(CANX、CYC1、GOLGA2和HSP90B1)（图3b）。

此外，蛋白质组学分析鉴定了491种在外泌体表面显著富集的蛋白（图3c）。KEGG和IPA通路分析显示，参与吞噬/内吞和细胞粘附的蛋白外泌体表面富集，与预期一致，同时参与抗原呈递和自身免疫的蛋白也富集。

 图2. PDAC细胞系外泌体的蛋白质组学分析

 

3. PDAC细胞系与患者血浆外泌体抗原一致

接下来，研究者评估了与对照组相比，蛋白质组学鉴定到的PDAC患者血浆中Ig结合分数较高的抗原是否在PDAC细胞来源的外泌体中富集。

研究发现，92个Ig结合蛋白中，有34个在PDAC细胞和外来体表面或提取蛋白质组中被发现（图4a）。然后研究者证实了PDAC患者血浆对34个胰岛素结合外体蛋白的反应性。有83种蛋白在免疫反应带中被识别，其中14种被鉴定为Ig结合外泌体抗原，与总细胞蛋白组相比，它们在PDAC细胞系来源的外泌体中富集。

免疫球蛋白透射电镜和流式细胞术分析证实，ANXA1, H2AF,PKM2, and HSPA8四种抗原均出现在PDAC细胞系来源外泌体表面（图4c）。92个Ig结合蛋白中有19个存在于血浆外泌体中，11个存在于PDAC细胞系外泌体中（图4d）。结果表明PDAC细胞系与患者血浆外泌体抗原一致。

 

图3. 外体抗原能够诱导PDAC患者产生自身抗体

小结

综上所述，研究人员使用基于质谱的蛋白质组学方法对来自胰腺导管腺癌（PDAC）患者血浆的免疫球蛋白结合蛋白和PDAC中的体液免疫应答相关的抗原库进行了深入研究，鉴定与外泌体标志蛋白一起诱导抗体应答的肿瘤抗原。

PDAC细胞衍生的外泌体分析结果揭示了其蛋白质成分与PDAC血浆中的免疫球蛋白结合蛋白的具有显著重叠。与健康对照相比，PDAC细胞衍生的外泌体和患者血浆之间存在显著的自身抗体反应性。最为重要的是，PDAC衍生的外泌体诱导PDAC血清介导的对癌细胞的补体依赖性细胞毒性的剂量依赖性抑制。

该研究提供了外泌体呈递大量肿瘤抗原的证据，外泌体肿瘤抗原诱导自身抗体并发挥针对补体介导的细胞毒性的诱饵功能。研究同样表明以蛋白质组学为代表的组学研究，对于肿瘤免疫及外泌体研究发展的重要意义。蛋白质组学的研究能为多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径，真正意义上实现疾病“精准治疗”无论在机制研究还是临床应用中“精准”的需求。

参考文献：

Capello M, et al., 2019, Exosomes harbor B celltargets in pancreatic adenocarcinoma and exert decoy function againstcomplement-mediated cytotoxicity. Nat Commun.