噬菌体展示原理和实践：构架篇（下）

前言

一个完整的噬菌体展示的构架包括噬菌体文库的构建，噬菌体的扩增和展示，淘选和筛选。前文已对噬菌体文库的构建，噬菌体的扩增和展示做了概述，此文是个人对噬菌体展示淘选和筛选的实践和见解的概述。噬菌体展示技术的抗体发现效率非常关键的地方在于淘选方法和筛选方法，淘选和筛选有着极为相似的抗体抗原相互作用的过程，但两者的目的并不完全相同，淘选更加侧重于阳性展示抗体的噬菌体的富集，筛选则更加侧重于阳性展示抗体与靶点抗原的亲和力大小的区分。在目的不尽相同的情况下，淘选需要选择合适的压力在保持阳性噬菌体的多样性的前提下来完成阳性噬菌体的富集，筛选则需要选择比较严格的筛选压力进行阳性噬菌体的亲和力大小区分。

抗体发现效率

根据JohnMcCafferty出版的一份文献记载¹，某个大小为1E10clones噬菌体文库，该文库针对292个抗原的噬菌体淘选和筛选结果，共发现了4000个不同的阳性抗体序列，抗体发现效率平均下来为13.7positive clones/1E10clones.在这些抗原中阳性抗体序列的数目从1个到100个不等，针对单一抗原，抗体发现的效率是1positive clone/1E8 ～1positive clone /1E10 clones.单一抗原的抗体发现的效率有100倍的差异和抗原本身的特性有关，也和淘选和筛选的方法有关。由于针对不同靶点的抗体要发挥其最佳的生理疗效可能有不同的亲和力大小的需求如拮抗类抗体的亲和力大小一般是nM~pM级别，双特异抗体中的CD3抗体往往是uM级别。在天然库的淘选过程中尽可能的得到具有多样性的亲和力抗体，在筛选过程中对这些多样性亲和力的抗体进行有效的区分是噬菌体展示淘选筛选过程中的具体目的，不同的目的就需要设计不同的淘选筛选方案。

淘选和筛选的一般流程

如下图所示，淘选的流程一般包括以下几个步骤：

1. 将靶点抗原或者带有抗原的物质直接或者间接的固定在固体载体

2. 加入噬菌体文库和抗原相互作用，使阳性噬菌体和抗原结合

3. 用洗涤液洗涤固体载体的表面，将未结合或者非特异弱结合的噬菌体洗去

4. 用强酸或者强碱破坏固体载体上抗原和阳性噬菌体的结合，从而得到阳性噬菌体溶液

5. 调整阳性噬菌体溶液的PH值后重新感染TG1大肠杆菌，加入辅助噬菌体后扩增阳性噬菌体

6. 重新开始步骤1-5，进行2-3轮淘选

高通量筛选的流程一般包括以下几个步骤：

1. 将淘选完的阳性噬菌体库感染TG1，涂平板挑单克隆在96孔板中进行扩增培养，并加入辅助噬菌体扩增得到每个孔是单克隆的噬菌体溶液

2. 将靶点抗原或者带有抗原的物质直接或者间接的固定在96孔板中

3. 点对点将单克隆噬菌体溶液加入固定了抗原的96孔板中相互作用

4. 用洗涤液洗涤固体载体的表面，将未结合或者非特异弱结合的噬菌体洗去

5. 用HRP偶联抗噬菌体衣壳蛋白的抗体和洗涤后的96孔板相互作用

6. 用洗涤液洗涤固体载体的表面，加入TMB显色后读数

7. 比较读数的大小，并对步骤1中单克隆TG1的96孔板进行测序。

淘选和筛选的化学本质

淘选和筛选的过程中均有噬菌体和靶点抗原的相互作用步骤，如何根据实验结果调整噬菌体和靶点抗原的相对多少是淘选方法和筛选方法优化的关键。噬菌体和靶点抗原相互作用的实质是蛋白间的可逆反应，可逆反应的过程意味着:有多少的阳性噬菌体能够和抗原结合，除了和两者Input的量相关以外还和两者之间的亲和力大小(解离平衡常数Kd)相关，JohnMcCafferty在PhageDisplay of Peptides and Proteins A Laboratory Manual一书的第七章节PhageDisplay: Factors Affecting PanningEfficiency中有过实验和理论的推导²，简而概之可以用下面的公式进行描述：

该公式说明了淘选和筛选过程中抗原的浓度选择对于淘选效率和筛选区分度的影响。

对于该公式的使用笔者选取亲和力Kd为1nM的抗体Ab1和选取亲和力Kd为10nM的抗体Ab2为例以下图进行说明。如果input的展示Ab1（红色实线）和展示Ab2（蓝色实线）的噬菌体的量是一样的。

在抗原浓度为10nM的条件下，90%的Ab1展示phage和50%的Ab2展示phage能够被抗原捕获，这样亲和力强的Ab1相对于亲和力弱的Ab2有更多的phage被淘选下来进入下一轮的扩增和淘选，如此2-3轮，强亲和力的Ab1展示噬菌体相对于弱亲和力的Ab2展示噬菌体有更多的富集，弱亲和力的Ab2相对于非特异或更弱结合的phage有更多的富集；

 
  如果将抗原浓度为1nM的条件下，50%的Ab1展示phage和9.1%的Ab2展示phage能够被抗原捕获，无论Ab1还是Ab2淘选的phage均有减少，但是淘选下来的Ab1/Ab2的量比值由抗原浓度为10nM时1.8倍上升到了5.5倍(绿色虚线)，抗原浓度减少时，Ab1相对于Ab2有更多的富集，抗原的浓度越少对抗体的亲和力大小越具有选择性。

淘选和筛选优化的基本原则

抗原浓度的变化引起的不同亲和力的阳性噬菌体结合的量和比例的变化规律指导实验人员在淘选过程中抗原浓度条件的设定时，从第一轮淘选到第三轮淘选，抗原浓度应是逐步降低的过程。³

第一轮淘选过程中input的噬菌体文库中多样性的每个噬菌体的拷贝数一般为10-100个，为了尽可能将弱结合能力(uM级别)的抗体展示phage也保留住，高浓度的抗原如10ug/ml进行淘选是非常有助于得到一个亲和力跨度较大多样性较好的阳性噬菌体文库。

在第二轮和第三轮筛选过程中可根据单克隆测序的结果将抗原浓度逐级降低到5ug/ml，2ug/ml等使得阳性噬菌体在进一步富集的同时亲和力更强的噬菌体得到更多数量的富集，如下图所示为一个经过三轮淘选后阳性噬菌体库感染TG1后挑选单克隆测序,利用Vbase进行抗体轻重链的CDR分析的概念图(序列纯属虚构,如有雷同纯属巧合),20个序列中只有6个特异序列,其中一个序列6个重复,2个序列有4个重复,1个序列分别有3个,2个,1个重复.实验结果中有重复序列出现说明淘选过程使得具备亲和力的噬菌体得到了富集,序列收敛,有多个序列出现重复说明阳性噬菌体文库的多样性得以保留,特异序列重复的次数暗示着此序列可能亲和力强的序列,但序列的富集程度还跟该克隆的噬菌体扩增的效率和展示的效率有关,序列重复的次数和亲和力强弱之间没有绝对的相关性。

经过合适轮数筛选阳性噬菌体得以富集并且阳性多样性得以保留的阳性噬菌体库可感染TG1后挑选单克隆后进行利用ELISA进行高通量筛选,高通量筛选的目的是将不同阳性噬菌体的亲和力强弱得以区分,ELISA检测信号强的克隆其亲和力强.要达到以上的目的,根据上文的公式两个亲和力相差10倍的展示噬菌体在抗原浓度为10nM,其信号差异为1.8倍,而在抗原浓度为1nM时其信号差异为5.5倍,尽可能少的抗原浓度和阳性噬菌体进行反应是提高筛选信号大小和亲和力强弱的关键.在实际操作过程中,受限于微孔板中噬菌体的产量,ELISA方法的检测灵敏性,ELISA各个环节的非特异交叉反应等,一个区分度很好的噬菌体展示筛选方法需要对ELISA各个环节的各个试剂耗材进行优化,下图是笔者进行一个噬菌体展示筛选方法开发时的优化方向以供各位同行参考,具体内容暂不作展开。

淘选效率的其他考量

噬菌体淘选的过程决定了能够得到多少特异的阳性噬菌体，筛选的过程是以数据大小的形式对多样性的阳性噬菌体的亲和力做一个初步的比较排序。相较而言，淘选过程在抗体发现过程中有着更重要的地位，在淘选过程中除了考虑噬菌体和靶点抗原的结合富集外，还需要考虑噬菌体和淘选过程中其他试剂物质材料的非特异或者非预期的结合，如噬菌体淘选溶液中的封闭剂蛋白成分的结合或者噬菌体和固体载体间的非特异吸附等，经过2-3轮淘选后也能够进行富集，这样如下图所示将噬菌体文库在和抗原相互作用之前或者相互作用之后和除抗原外的其他试剂材料成分提前孵育一段时间进行负向筛选是很有必要的事情⁴。负向筛选的模式对于以细胞为载体的靶点(肿瘤原代细胞或者高峰度表达抗原的稳转细胞)淘选，蛋白靶点特定位点（如pMHC）的淘选均有很好的指导意义。

将抗原包被在固体载体表面，抗原以一个面吸附在固体载体上往往会导致部分抗原的位点被屏蔽的现象，采用生物素标记抗原和噬菌体作用后再结合到有链霉亲和素的固体载体上能够有效的避免此类现象（称之为液相淘选），在这类实验设计的过程中注意生物素抗原的量和固体载体能够捕获的生物素抗原的量的关系。根据本人的实验经验蛋白和噬菌体在液相中的结合力相对于两者在液固两相中的结合力要弱，液相淘选更能够淘选得到亲和力较强的阳性噬菌体文库，将靶点蛋白生物素标记后加入链霉亲和素的固体载体中反应再和噬菌体进行反应也是能够避免抗原位点被屏蔽的同时保留弱亲和力的阳性噬菌体的折中方案。

展望：

噬菌体展示相对于杂交瘤在进行抗体发现的过程中有一个非常大的优势的一点在于噬菌体展示可添加负向筛选的过程，该过程能够使噬菌体展示技术能够对于靶点抗原的特定表位进行精确的抗体发现，相较于杂交瘤技术有更高的抗体发现效率如pMHC为靶点的TCRlikeantibody的发现⁵。抗原浓度对噬菌体展示淘选结果的影响可以理解为一种淘选压力，抗原浓度高则淘选压力低，抗原浓度低则淘选压力高，淘选压力除抗原浓度外，液相固相淘选，温度，pH值⁶，模拟肿瘤微环境的Buffer的成分等都可以作为一种可调节的淘选压力，通过灵活的调节淘选压力可以从噬菌体文库得到更多或者亲和力更强或者有某种特性的抗体，在中国新药研发逐步加入全球范围内的竞争格局下，有特色的将更具备价值，噬菌体展示技术的多方面更精密应用将是核心竞争力的源头技术。

希望同行从业者彼此之间能够相互交流讨论磨砺技能，有意者可联系[e-mail]一起交流讨论成长进步，为从业者提供更为贴近实践的技术信息。

参考资料：

1. Schofield D J , Pope A R , Clementel V , et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization[J]. Genome biology, 2007, 8(11):R254.

2. McCafferty, John. Phage display of peptides and proteins a laboratory manual /[M]// Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual. Academic Press, 1996.

3. Baker K P , Edwards B M , Main S H , et al. Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator[J]. Arthritis and rheumatism, 2003, 48(11):3253-3265.

4. SoiYun，SangahLee，Jong PilPark, ,et al. Modification of phage display technique for improved screening of high-affinity binding peptides[J]. Biotechnology Volume 289, 10 January 2019, Pages 88-92.

5. Yixiang Xu , Georgina To’a Salazar,  Ningyan Zhang,  Zhiqiang An.T-cell receptor mimic (TCRm) antibody therapeutics against intracellular proteins[J]. Antibody Therapeutics, Volume 2, Issue 1, 1 January 2019, Pages 1–11.

6. Kroetsch A , Qiao C , Heavey M , et al. Engineered pH-dependent recycling antibodies enhance elimination of Staphylococcal enterotoxin B superantigen in mice[J].