中药因其化学成分复杂多样，高效液相分离技术（HPLC）既是中药的化学成分分离鉴定常用的手段也是难度较大的工作。基于色谱技术的中药指纹图谱可从整体与宏观上表征被测中药的主要化学成分的特征，可较全面地反映中药所含化学成分的相对关系，是符合中药成分复杂性的特点、全面控制中药内在质量的重要方法[1-5]。但传统的一维色谱也存在分离度不够、中药中微量化合物的分析会受到常量化合物的干扰、峰重叠现象严重等问题[6]。全二维液相色谱（LC×LC）是将分离机制不同而又相互独立的两支色谱柱串联而构成的分离系统，样品经第一维色谱柱分离后，所有组分均通过阀切换转入第二维色谱柱进行分析的在线二维液相色谱系统[7]。全二维液相色谱于1978年由Erni和Frei[8]第一次构建，与一维液相色谱相比，其峰容量更大，分离能力更强；与离线二维液相色谱比，其操作及分析时间更短，适合复杂样品的在线分离。近年来，全二维液相色谱凭借其强大的在线分离分析能力，在中药以及中药复方样品中的应用逐渐增多[9-20]，成为了中药化学成分分离鉴定以及中药指纹图谱发展的一个新趋势。
牛黄上清丸（Niuhuang Shangqing Pills，NSP）由人工牛黄、栀子、大黄等19味药材组成，具清热泻火、散风止痛的功效，用于热毒内盛、风火上攻所致的头疼眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、大便燥结等[21]，为中医临床治疗实热证的常用代表性中药大复方。NSP组成药味多，成分复杂且各成分的含量相差较大，其质量控制难度大，《中国药典》2015年版以黄芩苷、栀子苷的含量指标来控制NSP的质量；也有研究者采用HPLC法对NSP进行单一成分或多组分的含量测定[22-24]，对NSP（片、胶囊）的挥发油特征图谱进行了研究[25]。其质量的全面整体控制方法尚有待研究。本研究以NSP为对象，研究建立了基于全二维液相色谱的NSP指纹图谱的方法，并对21批市售样品进行了相似度评价，以期为NSP的质量控制提供参考依据及新的评价方法。
1 仪器与材料
Shimadzu Nexera X2液相色谱系统，日本岛津公司，包括DGU-20A5R型在线脱气机、LC-30AD型二元泵×4、SIL-30AC型自动进样器、CBM-20A Communication Bus Module、SPD-M30A型二极管阵列检测器、CTO-20AC型柱温箱、FCV32AH型二位六通阀及2个100 μL的定量环；LabSolutions色谱工作站管理软件、LC×LC Assist Version 2.0软件、ChromSquare Version 2.2软件，日本岛津公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CP214型电子天平，奥克斯（上海）仪器有限公司；超纯水由Milipore-Simplicity超纯水处理系统（德国默克密理博公司）制得；色谱级甲醇、乙腈购自美国Tedia公司；色谱级甲酸购于Dikma Technologies公司；分析级甲醇购自西陇科学股份有限公司。
21批市售不同生产厂家及不同批次NSP样品分别为北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号4015259、4015721、4015724、15015002、15015007、15015097、15015148、15015208、15015213、15015317，编号S1～S10；吉林市鹿王制药股份有限公司，批号141201、150501、150502、150503、150504、150901，编号S11～S16；山西天生制药有限公司，批号116002、140804，编号S17～S18；内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，批号11150311、20131009，编号S19～S20；天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，批号5010069，编号S21。栀子苷（批号3662，质量分数99.6%）、黄芩苷（批号5719，质量分数99.5%）、汉黄芩素（批号5119，质量分数99.8%）、连翘苷（批号4367，质量分数97.5%）、连翘酯苷A（批号3639，质量分数99%）、藁本内酯（批号5408，质量分数94.5%）、绿原酸（批号2772，质量分数99.3%）、胡薄荷酮（批号5944，质量分数99.8%）、木犀草素（批号2226，质量分数99.3%）、芹菜素（批号6088，质量分数99.2%）、金合欢素（批号3431，质量分数99.5%）、盐酸黄连碱（批号6052，质量分数90%）、盐酸药根碱（批号3898，质量分数99.1%）、盐酸巴马汀（批号1904，质量分数99.6%）、盐酸小檗碱（批号5738，质量分数98.9%）、芍药苷（批号5859，质量分数98.9%）、欧前胡素（批号3621，质量分数99.6%）、甘草酸（批号5744，质量分数98.9%）、甘草苷（批号5594，质量分数99.8%），19个对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，各对照品在使用前通过UPLC分析确定其色谱峰的保留时间及紫外吸收光谱特征。
2 方法及结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 供试品溶液的制备 分别取各批次的NSP 1丸，均匀剪碎，精密称取约1.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，密塞，称定质量；超声处理60 min（功率500 W，频率40 kHz），取出并放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.2 混合对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加80%甲醇水溶液制得含栀子苷12 μg/mL、黄芩苷36.6 μg/mL、汉黄芩素14.8 μg/mL、连翘苷14.3 μg/mL、连翘酯苷A 14.8 μg/mL、藁本内酯25.5 μg/mL、绿原酸14.4 μg/mL、胡薄荷酮20.3 μg/mL、木犀草素13.0 μg/mL、芹菜素7.6 μg/mL、金合欢素12.3 μg/mL、盐酸黄连碱13.3 μg/mL、盐酸药根碱13.0 μg/mL、盐酸巴马汀15.0 μg/mL、盐酸小檗碱14.2 μg/mL、芍药苷15.0 μg/mL、欧前胡素14.0 μg/mL、甘草酸14.5 μg/mL、甘草苷13.4 μg/mL的混合溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 全二维液相色谱方法的建立
在全二维液相色谱系统中，LabSolutions色谱工作站管理软件用于运行控制Shimadzu Nexera X2液相色谱系统，LC×LC AssistVersion 2.0软件用于辅助第一维和第二维液相色谱的时间程序设定，全二维液相色谱的等高线图（Contour Plots）由Chrom Square Version 2.2软件生成。
全二维液相色谱系统的流路切换模式示意图见图1、2，样品经自动进样器进入一维（1D）泵单元，并经1D色谱柱进行分离，在1D分离柱上分离的馏分进入定量环A（Loop A）或者定量环B（Loop B）。当经1D色谱柱洗脱的馏分进入Loop A时，Loop B中已储存的馏分经二维（2D）泵单元引入2D分离柱，在2D分离柱中分离后，进入流通池并由检测器进行检测。同样地，当储存在LoopA的馏分被2D泵单元引入2D分离柱进行分离与检测时，1D色谱柱分离出的馏分则进入Loop B暂时储存。
连接在二位六通切换阀上的2个定量环体积相同，第一与第二维色谱的梯度洗脱是同时进行的，第一维的洗脱液进入Loop A或者Loop B，并经由阀切换转入第二维进行分离。在全二维方法建立的过程中，需同时考虑第一维色谱体积流量、定量环体积与阀切换时间的匹配，使经第一维分离的洗脱液能全部进入第二维，并在第二维的1个阀切换时间内被分析完。第二维的分离时间即为阀切换时间，1个阀切换时间也称作1个调制周期（modulation time）。如本研究的第一维液相色谱柱的体积流量为0.1 mL/min，定量环的体积为100 μL，则第二维的调制周期为1 min。利用时间程序生成软件“LC×LC Assist Version 2.0”，只需向软件中输入相应的信息即可自动生成第一维和第二维梯度洗脱程序。用该软件所获得的第一维和第二维梯度洗脱程序能够复制并转移到岛津公司LCMS工作站软件“LabSolutions”，并进行样品的全二维液相色谱分析。
2.3 全二维液相色谱分离条件
全二维液相色谱的进样量为2 μL，第一维色谱中，色谱柱使用AcquityUPLC HSS CYANO（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温40 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱：0～10 min，10%～30%甲醇；10～35 min，30%～45%甲醇；35～55 min，45%～65%甲醇；55～65 min，65%～95%甲醇；65～70 min，95%甲醇；体积流量0.1 mL/min。
第二维色谱中，使用Kinetex Phenyl-Hexyl（50 mm×3 mm，2.6 μm）色谱柱，柱温40 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，体积流量1.5 mL/min；DAD的样品采集速率为12.5Hz，检测波长为254 nm；第二维的调制周期为1 min，梯度洗脱程序的设置由时间程序生成软件“LC×LC Assist Version 2.0”辅助完成，其洗脱程序如表1和图3所示。图3-A中的蓝线代表第一维梯度洗脱运行的程序，红线代表第二维梯度洗脱运行的程序；图3-B中的黑线代表第二维的初始梯度洗脱程序。
2.4 全二维液相色谱指纹图谱的建立
2.4.1 精密度试验 取同一批样品（S1）的供试品溶液，连续进样6次，记录全二维液相色谱的等高线图，以黄芩苷为参比峰，计算各共有峰相对峰体积的RSD均小于5%，相对保留时间的RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验 取同一批样品（S1）的供试品溶液，分别在0、4、8、16、24、48 h进样，记录全二维液相色谱的等高线图，以黄芩苷为参比峰，计算各共有峰相对峰体积的RSD均小于5%，相对保留时间的RSD均小于5%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.4.3 重复性试验 取样品（S1）6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录全二维液相色谱的等高线图，以黄芩苷为参比峰，计算各共有峰相对峰体积的RSD均小于5%，相对保留时间的RSD均小于5%，结果表明方法重复性良好。
2.4.4 指纹图谱的建立及部分共有峰的指认 取NSP 21批（S1～S21），按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，依“2.3”项下色谱条件进行测定。通过对比21批NSP样品的全二维等高线图，并根据保留时间与紫外吸收特征，找出并确定了18个共有峰，图4为样品S1的全二维等高线图及18个共有峰在图谱中的位置。
取空白溶剂、供试品溶液和混合对照品溶液，依“2.3”项全二维液相色谱条件依次测定，在Labsolutions软件上先将供试品溶液和混合对照品的色谱图以空白溶剂作为背景进行扣除处理，再应用ChromSquare Version 2.2软件生成相应的等高线图。表2为19个混合对照品的一维液相色谱和全二维液相色谱保留时间信息，图5为19个混合对照品的一维色谱图与全二维液相色谱的等高线图。通过比对混合对照品和供试品的全二维等高线图指纹图谱共有峰第一维和第二维的保留时间及色谱峰紫外吸收光谱特征，确定21批NSP样品共有峰中的1号峰为栀子苷（混合对照品溶液中的1号峰），8号为胡薄荷酮（混合对照品溶液中的8号峰），9号为黄芩苷（混合对照品溶液中的11号峰），15号为欧前胡素（混合对照品溶液中的15号峰），16号为汉黄芩素（混合对照品溶液中的17号峰）。
2.4.5 指纹图谱的相似度（S）评价 经全二维液相色谱分析得到的数据是一个矩阵，为分别以第一维、第二维洗脱时间轴表示检测器信号的等高线 图[26]，得到的色谱图是三维指纹图谱。由于全二维液相色谱分离的色谱峰为三维体，其峰值大小以峰体积表示[27]。故采用峰体积表征NSP样品三维指纹图谱中共有峰的峰值大小。
将18个共有峰的峰体积进行归一化预处理，即以各样品中最大的峰体积为基准，其余色谱峰均除以该峰体积，得到归一化后的数据。在多指标评价体系中，当各指标间的水平相差很大时，如果直接用原始指标值进行分析，就会突出数值较高的指标在综合分析中的作用，相对削弱数值水平较低指标的作用。在相似度计算中，采用归一化预处理可以消除不同样品由于提取过程或进样等误差导致样品浓度不同而带来的影响，从而使S计算结果更为准确。故为保证结果的可靠性，有必要对原始数据进行标准化预处理。最终确定采用3种常用的方法欧氏距离、夹角余弦和相关系数法，并分别以各共有峰峰体积的中位数和平均数为标准对照指纹图谱，计算样品的S，结果见表3。
3 讨论
全二维液相色谱较传统的一维液相色谱峰分离能力强，峰容量有了很大的提高。以样品S1为例，在检测波长为254 nm下，经全二维液相色谱分析其有效分离的色谱峰超过100个，而以传统的一维液相色谱分析其有效分离的色谱峰则为40个左右。在一维液相色谱的重叠成分，可通过全二维液相色谱实现分离。如图6所示，样品S1在一维液相色谱保留时间为42 min的未分离色谱峰（图6-A），经全二维液相色谱分离后，在调制周期为43～44 min的等高线图中可观察到4个斑点（图6-B），其对应的色谱图含4个独立的色谱峰（图6-C）。
通过对21批NSP样品进行全二维色谱指纹图谱测定，根据保留时间与紫外吸收特征找出共有峰，并且对共有峰进行了方法学考察，确定了18个共有峰。全二维由于强大的分离能力，在共有峰的确认过程中，各批次间的共有峰数量较多，但在方法学考察时，共有峰中大部分含量较低的成分其峰体积的RSD值较大。其原因可能是与仪器的每一次切阀，对全二维液相色谱系统的影响不能完全准确一致有关。因此，本研究最终只选取了仪器精密度、样品的稳定性、方法的重复性考察时共有峰峰体积RSD值均小于5%的共18个共有峰。
3.2 全二维液相色谱条件的优化
在全二维液相色谱分离中，样品在第一维色谱柱的分离采用相对较长、内径较窄且粒径小的柱子以获得较好的色谱分离效果，并用较慢的体积流量洗脱，使洗脱液充分注入第二维色谱柱；在第二维色谱的分离采用较短的、内径较宽的色谱柱分离，并以较高的体积流量洗脱[28]。本研究中色谱柱组合方式采用RPLC×RPLC，在优化色谱柱的组合时，采用以下4根色谱柱并以体积流量为0.1 mL/min对第一维色谱分离进行测试：Acquity UPLC BEH ShieldRP18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC HSS CYANO（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC HSS PFP（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；第二维色谱分离采用Kinetex Phenyl-Hexyl（50 mm×3 mm，2.6 μm）、Kinetex XB-18（50 mm×3 mm，2.6 μm）色谱柱以及体积流量1.5 mL/min进行测试，应用以上色谱柱的组合分别对NSP样品S1进行分离，最终筛选出以Acquity UPLC HSS CYANO（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Kinetex Phenyl-Hexyl（50 mm×3 mm，2.6 μm）分别为全二维液相色谱系统的第一、二维色谱柱时样品S1的分离效果最好。
考虑到流动相的兼容性与适用性，流动相的溶剂系统采用甲醇水溶液和乙腈水溶液。并选用洗脱能力相对较强的乙腈作为第二维色谱柱的有机相，以洗脱能力相对较弱的甲醇作为第一维色谱柱的有机相，使从第一维色谱柱洗脱出来的样品能更好地聚集在第二维色谱柱的柱头，减小带宽效应[29]。通过参考文献方法[30]并对流动相的改性剂进一步考察，最终以甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液分别为第一维和第二维的流动相。
研究发现[13,31]在以反相色谱柱分别作为第一和第二维色谱柱的全二维液相色谱中，第二维采用漂移梯度程序（shift gradient）能显著提高第二维色谱的分辨能力。本研究的第二维采用漂移梯度程序方法进行梯度洗脱条件的优化，最后以样品的分离效果确定第二维的梯度洗脱程序（图2）。由于第一维刚开始（0～10 min）洗脱出来的组分在反向色谱柱保留的比较弱，所以第二维的洗脱程序跨度范围比较窄，乙腈从5%到30%，体积分数跨度为25%；而在第一维后期（35～55 min）洗脱出来的组分由于在反相色谱柱的保留较强，故第二维乙腈体积分数跨度设为45%。
3.3 相似度评价结果
在NSP尚无标准对照制剂的情况下，本研究采用了国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）的2种方法来生成标准对照指纹图谱：第1种是以平均数法生成对照指纹图谱；第2种是以中位数法生成对照指纹图谱。从表3可以看出，以平均法、中位数法生成的对照指纹图谱计算出的相似度结果基本一致，以平均数法生成对照指纹图谱并采用欧氏距离、夹角余弦和相关系数法计算21批NSP样品的相似度均值分别为72.25%、95.67%、93.40%；以中位数法生成对照指纹图谱并采用欧氏距离、夹角余弦和相关系数法计算21批NSP样品的相似度均值分别为76.62%、94.68%、91.83%。并且，采用的欧氏距离、夹角余弦和相关系数法3种评价结果中样品相似性的变化趋势一致，故3种相似度评价方法均能准确表征NSP各批次样品指纹图谱的相似性。
21批NSP的相似度值相差较大，采用中位数法生成对照指纹图谱并以夹角余弦法计算的相似度值其范围为74.10%～99.90%。其中，样品S1～S10（均为北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产）的相似度值范围为99.10%～99.90%，样品S11～S16（均为吉林市鹿王制药股份有限公司生产）的相似度值范围为74.10%～93.10%，山西天生制药有限公司（S17、S18）、内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司（S19、S20）及天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂（S21）的样品相似度值范围为92.90%～98.90%。以上结果表明，所测定的多个批次的NSP样品在不同生产厂家间的化学成分含量相差较大；同仁堂制药厂的不同批次样品的成分组成及其含量一致性较好，批次间质量较为稳定，而鹿王制药股份有限公司的不同批次样品的成分组成及其含量变异较大，批次间质量稳定性较差；其他生产厂家的样品（S17～S21）的相似度值接近同仁堂制药厂的各批次样品，其质量的稳定性介于同仁堂制药厂与鹿王制药股份有限公司之间。
3.4 小结
本研究建立了基于全二维液相色谱的NSP三维指纹图谱的方法，并对21批NSP样品进行相似度评价。全二维液相色谱系统的第一维与第二维的色谱柱由分离机制不同的两反相柱组成，第二维采用漂移梯度洗脱程序以提高全二维液相色谱系统的分离效能，建立的全二维液相色谱方法其分离能力明显优于传统的一维液相色谱方法。研究中采用的3种不同相似度评价方法均能准确表征NSP各批次样品指纹图谱的相似性，并且结果基本一致。本研究建立的NSP全二维三维指纹图谱及其相似度的评价方法切实可行，为有效控制NSP的质量提供新的方法，也是对传统一维液相色谱指纹图谱的补充和提高。
参考文献（略）
来 源：吴瑞军，钟国跃，曾金祥，何军伟，宋 伦，梁 健. 基于全二维液相色谱的牛黄上清丸指纹图谱研究 [J]. 中草药, 2019, 50(3):588-597.
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