几年前，单细胞领域还近乎一块未垦之地，研究的技术手段非常有限。当下，单细胞领域俨然成为一个众人摩拳擦掌的竞技场，高分文章不断，各大公司推出的新技术层出不穷。继10X Genomics 掀起一股热潮后，BD携Rhapsody单细胞分析系统强势登上单细胞研究的舞台，为学者们的单细胞研究带来新的技术手段和思路。
今天，小编将介绍BD Rhapsody单细胞分析系统。首先，这是一个明明可以靠脸吃饭，但是还要靠才华的时代，看看图1，是不是觉得Rhapsody颜值爆表？精巧的上样平台，可以同时分离2万甚至更多的单细胞；自带10吋触摸屏的成像系统，可以对样本进行全面质控，真是要颜值有颜值，要“才华”有“才华！
图1：Rhapsody硬件、耗材、试剂、数据处理和分析工具
下面，就是介绍Rhapsody的技术啦！
图2: Rhapsody单细胞转录组整体解决方案
1、单细胞分离、裂解、mRNA捕获
图3：Rhapsody微孔和磁珠
Rhapsody利用微孔进行单细胞分离，属于Microwell-seq。20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead（磁珠），bead上连接逆转录引物，引物主要包括以下三个部分：（1）CL（cell label，细胞标签），一个磁珠上的引物CL序列相同，不同磁珠上的引物CL序列不同，从而达到区分细胞的作用；（2）UMI（unique molecular identifier），一个磁珠上的引物UMI各不相同，可以区分最初的mRNA分子，以便后期分析时消除扩增带来的偏差；（3）poly dT，和mRNA 3’端poly A互补配对。同时，细胞悬液被稀释到适当浓度，微孔随机捕获单细胞，单细胞捕获效率约为80%，捕获1K个细胞出现的多细胞比率约为0.2%，捕获10K个细胞多细胞比率约为2.4%。Rhapsody建议的检测通量为100-10000。
图4：单细胞分离和mRNA捕获流程
当微孔捕获到单细胞和磁珠以后，使用细胞裂解液，细胞裂解释放出mRNA，经孵育以后mRNA的poly A和磁珠上的poly T互补配对。然后，使用磁铁回收磁珠，进行下一步的逆转录（cDNA合成）。Rhapsody拥有单细胞成像系统（BD独家技术），对细胞存活、多细胞比率、同时含有单细胞和磁珠的微孔数等方面进行质控，有效保证实验成功率。
图5：单细胞成像系统
2、cDNA合成、引入分子标签、目标基因扩增、文库构建
回收磁珠以后进行逆转录，通过cDNA合成引入UMI和Cell Label，同一细胞来源的所有mRNA分子都被标记上相同的CL，同一细胞来源的不同mRNA分子都被标记上不同的UMI。
图6：磁珠上合成cDNA
接下来，通过多重PCR对靶向基因进行扩增。先使用PCR1 primer（外引物）对cDNA进行较大片段的扩增，再使用PCR 2 primer（内引物）对cDNA进行较小片段的扩增。使用多重PCR的目的是增加靶向基因扩增的特异性。最后给cDNA加上index（方便测序时区分样品，一条lane可同时对多个样品测序）和测序接头，文库构建完成。
图7：通过多重PCR对靶向基因进行扩增
3、测序原始数据处理、细胞聚类，差异基因分析
图8：原始数据处理
构建好的文库经二代测序以后，对测序原始数据进行处理。现以图8为例进行简单说明，根据Cell label 区分细胞（图中有两个细胞），根据UMI区分最初的mRNA分子数。接着，便可进行细胞聚类，基因差异分析。BD Rhapsody提供可视化的分析工具，操作简便，不需要专业的生物信息学知识，分析结果可输出，可用于文章发表。
图9：细胞聚类，差异基因分析
针对不同的靶向基因，Rhapsody的panel灵活可变，目前有商业化panels（每个panel包含～400个基因）、定制化panels（每个panel包含～200 – 500个基因）、补充panels（最多可以补充100个基因）。
4、Rhapsody发表文献和应用实例
图10为Rhapsody发表文献（SCIENCE），目前，Rhapsody应用实例包括检测乳腺癌组织中癌细胞特异表达的基因、追踪T细胞体外分化、绘制小鼠脾脏组织的细胞异质性等。
图10：Rhapsody发表文献
5、Rhapsody优势
图11：靶向测序的灵敏度更高，测序成本更低
Rhapsody最主要的优势有两个。首先，由于是靶向测序，Rhapsody的灵敏度和特异性更好，同时测序成本更低（如图11）；其次，Rhapsody可以利用抗体标记多个样品，对多个样品同时进行建库测序，BD公司凭借在蛋白抗体方面的雄厚底蕴，做到了这一点。
图12：利用DNA序列标记抗体
Rhapsody利用抗体标记多个样品，和传统的流式细胞分析方法（Flow cytometry）很类似，只是传统抗体末端连接的荧光基团被替换成了DNA barcode，标记不同样品的DNA barcode不同，DNA barcode带有poly A tail，而逆转录酶同时具有DNA聚合酶活性，DNA barcod片段和mRNA一起被建库测序，最终我们能够根据DNA barcode区分不同的样品。样品标记技术可以识别不同来源细胞形成的多细胞，去除多细胞可减少干扰，使数据更清晰。Rhapsody成功试验同时标记12个样品。
6、Rhapsody蛋白定量技术：单细胞转录组+蛋白组多维组学研究
从本质上讲，蛋白质才是生命活动的直接承担者。mRNA的丰度并不能直接反映蛋白质的丰度，因为蛋白表达还受转录后调控。同时，绝大部分单细胞转录组测序属于3’端测序，很难区分mRNA的可变剪切体，而通过检测蛋白可以区分mRNA的可变剪切。Rhapsody使用蛋白定量技术，进行单细胞转录组+蛋白组多维组学研究，不仅提高了解析度，而且两个维度相互验证，实验结果将更具说服力。
Rhapsody蛋白定量技术的原理，和上文提到的样品标记技术原理一样（如图13），蛋白丰度越高，结合的抗体越多，通过分析抗体末端的DNA片段，就可以得知是哪一种蛋白以及它的表达情况，目前BD Rhapsody已完成对42种蛋白同时进行定量，将来会扩展到数百种。
图13：单细胞蛋白组及转录组测序流程
2017年，默克公司在Nature上发表文章（doi:10.1038/nbt.3973，文章影响因子高达43.3分），进一步推进了单细胞转录组+蛋白组多维组学研究。相信不久后，单细胞多维组学研究将迎来属于它的春天！
图14：默克公司单细胞转录组+蛋白组测序研究思路
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