人类基因组变异数据库（ClinVar database）含有54，444个致病的遗传变异，其中58%属于点突变[1]。 2017年哈佛大学的David Liu团队开发了一种新型腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）[2](详见：突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC)，因为ABE7.10能使腺嘌呤(A)脱氨后会变为肌苷(I)， DNA聚合酶在复制的时候把它识别为G，从而实现了A到G的置换；这样A·T碱基对就能转换为G·C碱基对，从而纠正47%的致病单碱基（图1）[1]，有望治愈14,841种点突变相关的遗传疾病。由此可见，ABE单碱基编辑系统在基因治疗领域有着极其广泛的应用前景（张锋教授和David Liu教授等人共同创立了基于单碱基编辑技术的基因治疗公司Beam Therapeutics， 从2018年5月到现在已经完成A、B两轮共2.22亿美元融资）。因此，全面准确地评估该系统在全基因组水平上的特异性是个亟待解决的问题(详见：基因编辑技术的临床应用需要更精准的安全评估工具)。
1 33，739种致病点突变
3月4日，韩国首尔国立大学Jin-Soo Kim团队在Nature Biotechnology上发表了题为Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors 的研究论文，用改进版的Digenome-seq评估了腺嘌呤碱基编辑器（ABE）在人类细胞系全基因组水平上的脱靶效应。
Jin-Soo Kim团队近年的部分工作是致力于CRISPR系统脱靶效应评估工具的开发。他们发现Cas9、单碱基编辑器ABE7.10和BE3这些系统对sgRNA与靶点DNA之间1到2个碱基的错配的耐受，提示它们都有潜在的脱靶效应。为此，2015 年他们团队在Nature Methods上报道了基于Cas9系统能切割体外DNA形成DSB的特点开发了Digenome-seq，评估了CRISPR/Cas9在全基因组水平的脱靶效应[3]；发现Cas9系统的特异性还是非常的高，只检测到了为数不多的脱靶位点。
单碱基编辑器BE3由APOBEC-XTEN-Cas9n-UGI构成， Cas9n会在与sgRNA互补的DNA链上产生一个切口；APOBEC则会把另一条DNA链上的胞嘧啶（C）脱氨后转化为尿嘧啶（U），然后利用尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase，UDG）和核酸内切酶Ⅷ （DNA glycosylase-lyase endonuclease VIII）作用后会形成一个的缺口，从而形成DSB位点，可用于脱靶效应的评估。改进版的Digenome-seq于2017年发表在Nature Biotechnology上，发现BE3系统的特异性比Cas9的还高[4]。
单碱基编辑器ABE 和CBE 都是利用碱基脱氨的工作原理，因此如何产生ABE单碱基编辑系统（ABE7.10）的DSB是用Digenome-seq在全基因组水平上评估脱靶效应的关键。ABE7.10由wtTadA-TadA*7–XTEN–Cas9n构成，定向演化后的TadA能高效地把腺嘌呤（A）脱氨后产生次黄嘌呤（I），用核酸内切酶V（它能切割DNA链上次黄嘌呤的磷酸二酯键）或烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（human alkyladenine DNA glycosylase ，hAAG）/核酸内切酶Ⅷ联用来产生一个切割位点，另一个由Cas9n产生，由此诞生了评估ABE脱靶效应另一个改进版的Digenome-seq。他们测试了7个靶点的脱靶数，发现ABE系统（脱靶数60 ± 20）的脱靶效应比Cas9系统（脱靶数70 ± 30）低，但高于BE3系统（脱靶数8 ± 3）。
如何才能降低单碱基编辑器ABE7.10的脱靶效应呢，优化sgRNA的序列、CRISPR核酸复合物的递送和优化Cas9蛋白三个方面入手。发现以下三种策略均能提高特异性：1）在sgRNA的5’端加1到2个G碱基有助于提高特异性（2-26倍），2）使用Sniper-Cas9（经过演化提高了特异性的Cas9），3）ABE7.10与sgRNA预组装好导入细胞。
附：BioArt独家采访了Jin-Soo Kim，原文如下：
There are two types of off-target mutations, sgRNA-dependent or sgRNA-independent.
Digenome-seq is a method of using whole genome sequencing to determine sgRNA-dependent off-target sites in an unbiased manner.
We found that ABEs, CBEs, and Cas9 often recognize different sets of off-target sites, calling for independent assessments of each tool.
We also showed that sgRNA-dependent off-target activity of ABEs can be substantially reduced by replacing the wild-type Cas9 with Sniper-Cas9, an engineered Cas9 variant, and by using pre-assembled ABE ribonucleoproteins (RNPs) rather than plasmids.
翻译：脱靶突变一共有两种：sgRNA依赖型与sgRNA非依赖性。Digenome-seq是一种利用全基因组测序无偏差检测sgRNA依赖型脱靶突变的方法。“我们”发现ABEs，CBEs以及Cas9经常会识别不同的脱靶位点，因此需要不同的评估方法。另外，我们还发现可以通过以下方法减低ABEs的sgRNA依赖型脱靶活性：利用突变型Cas9即Sniper-Cas9代替Cas9，利用预组装的核糖体蛋白代替质粒。
另三项相关工作分别是：
1月8日，中山大学松阳洲/黄军就课题组在Nature Communications上报道了首个全基因组范围内检测ABE系统脱靶位点的方法——EndoV-seq (详见：松阳洲/黄军就课题组开发首个腺嘌呤单碱基编辑系统特异性评估工具)。
3月1日，Science 同时发表了两篇评估在体（in vivo）基因编辑脱靶效应的研究论文：杨辉/李亦学/ Steinmetz团队开发了在小鼠全基因组水平灵敏、无偏的检测基因编辑的方法——GOTI技术，该方法是基因编辑工具的安全性评估重大突破，有望成为行业检测的标准；中科院遗传发育所高彩霞团队运用克隆水稻植物来评估ABE碱基编辑系统在全基因组范围内的脱靶效应。两项独立的研究都证明ABE单碱基编辑器具有非常高的特异性(详见：专家热评Science丨杨辉组高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应)。
值得注意的是EndoV-seq 和Digenome-seq两种方法均是在体外处理DNA样本得到的脱靶效应信息，并且它们不能检测到Cas9n或 sgRNA不依赖产生的突变，方法的局限性显而易见。
这四个工作的审稿周期（按投稿时间）：
1、松阳洲/黄军就团队 （审稿时间最长）
Genome-wide Profiling of Adenine Base Editor Specificity by EndoV-seq
2、Jin-Soo Kim团队
Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors
3、杨辉/李亦学/ Steinmetz团队
Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos
4、高彩霞团队（审稿时间极短）
Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice
参考文献
1. Rees HA, Liu DR: Base Editing: Precision Chemistry On the Genome and Transcriptome of Living Cells. NAT REV GENET 2018, 19,770-788.
2. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR: Programmable Base Editing of a*T to G*C in Genomic DNA without DNA Cleavage. NATURE 2017, 551,464-471.
3. Kim D, Bae S, Park J, Kim E, Kim S, Yu HR, Hwang J, Kim JI, Kim JS: Digenome-Seq: Genome-Wide Profiling of CRISPR-Cas9 Off-Target Effects in Human Cells. NAT METHODS 2015, 12,237-243, 1-243.
4. Kim D, Lim K, Kim ST, Yoon SH, Kim K, Ryu SM, Kim JS: Genome-Wide Target Specificities of CRISPR RNA-guided Programmable Deaminases. NAT BIOTECHNOL 2017, 35,475-480.
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