大家好,本周推荐一篇发表在Nature communications上的文章:Proteome-wide solubility and thermal stability profiling reveals distinct regulatory roles for ATP,通讯作者是来自欧洲EMBL的Mikhail M. Savitski教授和葛兰素史克公司Marcus Bantscheff。
三磷酸核苷酸(NTPs)在细胞的生化过程中起着非常重要的作用,细胞中最丰富的NTP是三磷酸腺苷(ATP),因其作为细胞能量来源,调节蛋白质磷酸化以及影响大分子组装而受到充分研究。近些年来,研究发现ATP也是一种生物助水溶剂(能增加某些微溶于水的有机化合物的溶解度)。
本篇文章作者使用质谱法在蛋白质组层面对ATP介导的蛋白质热稳定性和蛋白质溶解度的调节进行全局性的研究。为了使体系更加接近天然的细胞环境,作者使用机械破坏细胞从而得到包含不溶性蛋白质,蛋白质缩合物和嵌入脂质中的膜蛋白得到粗裂解物,进一步通过设置一系列ATP浓度以及温度处理细胞,利用热转变方法与多重定量质谱相结合,从而得到在蛋白质组层面上的ATP相关2维热蛋白质图谱(2D-TPP)。同时作者也做了GTP相关2维热蛋白质图谱,发现ATP和GTP引起的热稳定性中存在crosstalk,比如两者都可以稳定一些激酶和含有p-loop的蛋白质。
进一步作者发现,超过一半的受ATP影响的蛋白质在UniProt中并没有注释为ATP或GTP结合物。作者猜测是因为ATP结合复合物亚基的热稳定可以传播至近端非ATP结合亚基。并挑选了蛋白酶体作为例子进行阐释,19s中复合体中结合ATP的PSMC亚基和非ATP结合PSMD亚基都可以被ATP稳定。而没有ATP结合亚基的20S核心颗粒的热稳定性没有改变,所以ATP诱导的稳定化仅传到物理上接近的亚基上,进一步作者也在复合物的全局分析进行证明。
作者又使用2-脱氧葡萄糖和抗霉素A处理细胞,从而对糖酵解和氧化磷酸化的过程进行抑制,降低细胞中的ATP水平(约10%),对蛋白质组的热稳定性进行分析。发现△Tm变化最大的是ATP结合并稳定的蛋白质,结合ATP的蛋白复合物的△Tm比不结合的蛋白复合物小,蛋白酶体的19s比与20s △Tm有明显下降。
进一步作者在2D-TPP实验中发现有些蛋白质在高ATP和GTP浓度时,即使加热到42度时,蛋白质的丰度也有明显变高。由于近段时间发现ATP也是一种生物助水溶剂,所以作者发展了溶解性蛋白质组分析技术(SPP)对ATP在蛋白质组溶解性中扮演的角色进行系统地评估。作者将细胞裂解液分成十份,其中九份中加入温和的变性剂NP40用于溶解膜蛋白和细胞器连接蛋白,并加入不同浓度梯度的Mg-ATP,第十份中加入强变性剂SDS。当SDS/NP40的值很大时,说明这个蛋白具有高的非可溶部分。作者利用这个技术鉴定到了188个ATP依赖溶解的,被确定为不溶的蛋白质,占所有不溶蛋白质组的25%,这些蛋白质大部分被注释为无膜细胞器的组成部分。作者也做了使用2-脱氧葡萄糖和抗霉素A处理细胞,降低细胞中的ATP水平,对蛋白质组的溶解性性进行分析,发现在加入ATP溶解度非常敏感的蛋白质稳定性下降最快。
综上,作者的TPP和SPP实验共同揭示了蛋白质组中ATP的浓度依赖性的稳定性和溶解性作用。在低浓度(低于500μM)下,ATP主要稳定ATP结合蛋白,例如作为核苷酸结合蛋白的底物,在中等浓度(1-2mM之间)下,ATP发挥着对蛋白质复合物稳定性的重要作用,在较高浓度(大于2mM)下,ATP具有增溶作用,主要是结合核酸的带正电荷的无序蛋白质。
作者:YF
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