点评丨薛宇(华中科技大学)
责编丨迦溆
编者按:这篇文章适合先看点评!
专家点评
薛宇(华中科技大学生命科学院教授,蛋白质翻译后修饰研究专家)
翻译后修饰很重要。新生的、未经修饰的蛋白质,就像是澡堂子里光屁股的人群,眼前一片白花花啥也看不出来,洗完澡各自穿上马甲,这就清楚了:有工人、农民、学生、军人、老板和出来打酱油的路人甲乙丙丁等等。所以修饰就是蛋白质的小马甲。我们穿马甲不止一件,上班的时候穿上白大褂装实验学家,上课的时候西装革履假装有学问的老教授,踢球的时候要穿球衣表示自己是30年的红魔死忠,回家了之后当然是换上膝盖加厚型的跪搓衣板套装当媳妇儿的出气筒。所以修饰也不止一种,除了常见的磷酸化、泛素化、乙酰化和SUMO化等,还有许许多多功能尚不清楚的修饰,零零总总加起来目前已发现648种不同类型的修饰(https://www.uniprot.org/docs/ptmlist)。小马甲有什么用?我们穿上白大褂就一脸严谨,西装革履就文质彬彬,套上球服那就是华科加图索,换上跪搓衣板套装那自然就是皇上身边的公公。修饰也一样,可以通过影响底物蛋白质的结构、酶活性、细胞亚定位或相互作用等等,参与调控几乎所有的生物学过程。
棕榈酰化很重要,属于脂质修饰(Lipid modification)的一种,在棕榈酰转移酶DHHC蛋白的催化作用下,将包含16个碳原子(C16)的饱和脂肪酸,即棕榈酸可逆的共价连接到底物蛋白质的半胱氨酸上。脂质修饰有很多种,还包括肉豆蔻酰化(Myristoylation, C14)、法尼基化(Farnesylation, C15)和香叶酰香叶酰化(geranylgeranylation, C20)。棕榈酰化是硫代酰化,O=C-S键要比O=C-O键的亲和力弱。这一点很重要,因为目前发现的许多种脂质修饰,除了棕榈酰化都不具有可逆性,通常在蛋白质翻译出来之后就立即被修饰,因此也称为共翻译修饰(Co-translational modification)。修饰具有可逆性才能被动态的调控,因此棕榈酰化的调控机制解析是重要的生物学命题。
膜蛋白是重要的蛋白质,通常认为膜蛋白质的跨膜结构域插入到双分子层的膜中,从而使得膜蛋白能够稳定的呆在膜上。但问题在于,有相当多的蛋白质没有跨膜结构域,也可以定位到细胞膜上。这些蛋白质上膜的机制之一,就是棕榈酰化。棕榈酰化调控蛋白质上膜,至少有四种机制。第一,蛋白质有单次跨膜结构域,通常在跨膜结构域邻近的半胱氨酸发生棕榈酰化之后,能够提高蛋白质跨膜的稳定性,例如本文PD-L1的棕榈酰化,发挥的就是这个功能;第二,某些蛋白质第一个甲硫氨酸剪切掉之后,第二个甘氨酸可以发生肉豆蔻酰化从而上膜,但上膜的稳定性,却由蛋白质序列中段的半胱氨酸棕榈酰化来决定;第三,某些蛋白质的C端可发生法尼基化或香叶酰香叶酰化,其膜定位的稳定性也由蛋白质中段的棕榈酰化所决定;第四,多位点的棕榈酰化蛋白质,可以直接稳定在膜上。总结来看,单次跨膜结构域或其他脂质修饰,都相当于给蛋白质钉上一个不可拿掉的钉子,从而钉到膜上。问题是一个钉子不稳定啊,您往墙上钉相片就一个钉子?两个才稳定撒。细胞也是一样,棕榈酰化就是那个活动的钉子。发生去棕榈酰化,蛋白质在膜上就不那么稳定了,可以从膜上掉下来。
棕榈酰化不算是新修饰,上世纪70年代末由日本科学家发现,到今天已有有50多年了,一直没有什么热度。棕榈酰化不热,是因为一直没有发现什么重要的功能。生物学家跟做生信的不一样,生信一看,呦,没人做,赶紧做了发掉占坑;生物学家要看功能,有功能就重要,没功能那就不重要。所以06年咱开始做棕榈酰化位点预测的时候 【1】,一直是被批评,因为那时候棕榈酰化的确是没发现什么功能。棕榈酰化没功能,论文就很难投,所以做到11年终于放弃了。当然CSS-Palm软件还在(http://csspalm.biocuckoo.org/),更新到了4.0版本,没投,主要是投不出去。这几年来棕榈酰化开始重要了,例如,波士顿大学崔儒涛教授等人发现棕榈酰化激活黑皮质素受体MC1R,调控黑色素生成从而抑制黑色素瘤,其中MC1R的两个棕榈酰化位点是用CSS-Palm预测的【2】(Nature:崔儒涛组揭示棕榈酰化修饰或可有效预防皮肤癌丨亮点推荐)。再有就是氯喹衍生物通过抑制去棕榈酰酶PPT1的活性,使得溶酶体内蛋白质棕榈酰化水平上调从而贴膜,不能有效被溶酶体降解,从而干扰了溶酶体的正常功能,能够有效地抑制肿瘤生长【3】。所以棕榈酰化与肿瘤的关系,逐渐成为研究热点。
杰哥的工作,非常重要。PD-L1是天皇巨星级别的重要分子,只要有重要的新功能发现,一定会成为研究热点。其次,研究明星分子事实上并不容易,因为关于PD-L1的功能研究实在是太多了,例如18年初哈佛大学魏文毅等人就报道了泛素化调控PD-L1稳定性的机制 【4】。但棕榈酰化调控PD-L1的稳定性,这个角度实在是太刁钻了,也确实是非常新颖,没法理解杰哥为啥能想到棕榈酰化。第三,杰哥这个工作,讲的是棕榈酰化在肿瘤免疫中的重要作用,这就等于开辟了一个全新的研究方向,既能够促进肿瘤免疫的相关研究,也能够提升棕榈酰化的重要性。国内目前做棕榈酰化的学者不多,所以我看好杰哥未来会成为国内这个方向的领军学者,但愿能让棕榈酰化形成一个有特色的研究领域。
这就要讲到本评论的核心问题:杰哥为什么会做棕榈酰化?话说16年某个培训班杰哥有时候坐我前面,有时候坐我后面,一来二去就熟悉了。后来大家相忘于江湖,主要的互动就是朋友圈点赞。17年2月某一天,我在办公室敲键盘写基金的时候,杰哥突然打了电话过来,说棕榈酰化位点怎么鉴定?我想了想,说实验方法基本上是没有的,要不你试试我的CSS-Palm?杰哥说,这玩意儿准吗?咱卖瓜的哪能说瓜不甜捏?回答:非常准。当然喽,咱搞生信的站着说话不腰疼,反正又不是我做实验。问题在于,杰哥相信了,并且还真的做出来了。这个…我也是很服的。所以21世纪什么最重要?信任。有些人是注定会成为好友的。
最后谈一谈这个工作的延续。杰哥这个工作是个起点,还有许多工作可以做。实验学家们怎么做咱搞不清楚,但搞生信的,理论上可以用2-BP处理肿瘤细胞,做个时间序列的转录组、定量蛋白质组和定量泛素化组。棕榈酰化调控PD-L1上膜抑制其泛素化降解,那么从多组学里就可以直接看到PD-L1在转录水平无变化,蛋白质表达上升,泛素化水平下降。根据这个模式,理论上可以发现一批与PD-L1类似的、参与调控肿瘤的蛋白质,用工具预测棕榈酰化位点,再做个功能筛选,应该可以发现新的调控因子。这个想法跟杰哥讨论过,有机会得试试。
参考文献:
1. Zhou F, Xue Y, Yao X, Xu Y. (2006) CSS-Palm: palmitoylation site prediction with a clustering and scoring strategy (CSS). Bioinformatics, 22(7):894-6.
2. Chen S, Zhu B, Yin C, Liu W, Han C, Chen B, Liu T, Li X, Chen X, Li C, Hu L, Zhou J, Xu ZX, Gao X, Wu X, Goding CR, Cui R. (2017) Palmitoylation-dependent activation of MC1R prevents melanomagenesis. Nature, 549(7672):399-403.
3. Rebecca VW, Nicastri MC, Fennelly C, Chude CI, Barber-Rotenberg JS, Ronghe A, McAfee Q, McLaughlin NP, Zhang G, Goldman AR, Ojha R, Piao S, Noguera-Ortega E, Martorella A, Alicea GM, Lee JJ, Schuchter LM, Xu X, Herlyn M, Marmorstein R, Gimotty PA, Speicher DW, Winkler JD, Amaravadi RK. (2019) PPT1 Promotes Tumor Growth and Is the Molecular Target of Chloroquine Derivatives in Cancer. Cancer Discov., 9(2):220-229.
4. Zhang J, Bu X, Wang H, Zhu Y, Geng Y, Nihira NT, Tan Y, Ci Y, Wu F, Dai X, Guo J, Huang YH, Fan C, Ren S, Sun Y, Freeman GJ, Sicinski P, Wei W. (2018) Cyclin D-CDK4 kinase destabilizes PD-L1 via cullin 3-SPOP to control cancer immune surveillance. Nature, 553(7686):91-95.
论文详细解读:
免疫检查点(immune checkpoints)是分布于体内免疫系统中的抑制性信号通路,能够调控免疫反应的强弱和持续时间,避免组织损伤并维持机体自身的耐受。肿瘤能够利用免疫检查点通路的抑制作用,逃避免疫细胞的识别,特别是抑制T细胞的免疫应答,实现免疫逃逸。因此,抑制免疫检查点可以激发免疫系统原有的抗肿瘤能力。靶向免疫检查点蛋白CTLA-4、 PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经被批准用于治疗多种类型的恶性肿瘤。
然而免疫检查点阻断疗法仍存在总体有效率不高、长期使用后产生耐药以及可发生严重副作用等问题。PD-L1是PD-1的主要配体,一部分肿瘤依赖其表达的PD-L1结合T表面的PD-1并引起T细胞衰竭,促使肿瘤逃避宿主免疫系统的监视和杀伤作用。因此对PD-L1调控机制的深入研究将有助于改善治疗的效果。近年来的研究发现PD-L1不仅表达在细胞表面,还存在于细胞内的高尔基体、循环内体以及微囊泡上;细胞内的PD-L1具备促癌功能,并可重新被转运到细胞表面。因此旨在彻底清除PD-L1的靶向蛋白质降解策略受到关注。上海交通大学医学院附属仁济医院消化所的许杰课题组近期发现了PD-L1的溶酶体降解机制,并在HIP1R蛋白调控模式的启发下设计了PD-LYSO用于靶向降解PD-L1【1】(Nat Chem Biol 许杰组发现PD-L1溶酶体降解机制并开发靶向PD-L1的新分子PD-LYSO)。关于PD-L1的蛋白降解研究,2017年哈佛大学魏文毅教授在Nature上的工作表明cyclinD-CDK4 和SPOP(Cullin3相结合的E3连接酶)可以调控PD-L1的蛋白水平【2】。
2019年3月25日,许杰课题组在Nature Biomedical Engineering 上发表的题为Inhibiting PD-L1 palmitoylationenhances T-cell immune responses against tumours论文中,报道了PD-L1的棕榈酰化修饰促进其表达的机制,并设计开发了可竞争抑制PD-L1棕榈酰化的靶向多肽分子,为免疫检查点抑制剂开发提供了新的思路。
棕榈酰化修饰(Palmitoylation)是一种可逆的蛋白质脂类修饰方式,其中S型棕榈酰化修饰表现为16 个碳的棕榈酰通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨酸的巯基上,可调控蛋白质的转运、稳定性、与细胞膜的结合等过程。棕榈酰化由一类活性中心含有Asp-His-His-Cys(DHHC)的棕榈酰转移酶(Palmitoyl Acyltransferase)催化,因此也被称为DHHC家族,在哺乳动物中有20多个成员。
为了初探棕榈酰化修饰对PD-L1表达的影响,许杰课题组与复旦大学生物医学研究院陆豪杰教授课题组合作,利用棕榈酰化特异性抗体确定了有效调控细胞棕榈酰化的实验条件,并发现2-溴棕榈酸(2-BP)可显著抑制肿瘤细胞PD-L1的表达。
作者采用点击化学方法确认了PD-L1棕榈酰化的存在,并与华中科技大学生命科学院薛宇教授课题组合作利用css-palm模型预测了PD-L1的修饰位点,采用定点突变结合点击化学的方法验证了C272氨基酸的修饰的存在(下图)。该位点处于PD-L1的胞内区,信息学预测和突变实验均提示C272单一修饰位点的存在。
研究者发现抑制棕榈酰化会导致PD-L1向晚期内体和溶酶体的转运以及降解,因而采用不同的生化和细胞分子生物学实验来阐明具体的机制。他们发现棕榈酰化修饰显著抑制PD-L1的泛素化修饰,而后者可促进内体分选转运复合体 (ESCRT) 结合PD-L1并将其导入多囊体(MVB)和溶酶体进行降解。通过这种机制,棕榈酰化显著地抑制肿瘤细胞PD-L1的降解,从而抑制T细胞对肿瘤的杀伤作用。
通过分析全部DHHC成员在肿瘤中的表达并对多个DHHC进行敲低和验证,作者发现了在肿瘤细胞中对PD-L1棕榈酰化发挥主要调控作用的DHHC3棕榈酰转移酶。在多种肿瘤细胞中,DHHC3和PD-L1存在显著的结合与共定位,且组织芯片染色表明DHHC3的表达和PD-L1呈正相关。在小鼠的MC38肿瘤细胞中,干扰DHHC3的表达也造成了PD-L1蛋白质的显著下调,并对MC38细胞移殖瘤在C57小鼠体内的生长造成显著抑制。
为了明确棕榈酰化的小分子阻断剂作为PD-L1抑制剂的潜在价值,四川大学生物治疗国家重点实验室石虎兵教授课题组采用不同浓度的2-BP注射携带MC38肿瘤的小鼠,发现40mg/kg剂量的多次注射可以显著抑制肿瘤生长,并检测到PD-L1表达的降低以及CD8+细胞在肿瘤组织浸润的增加。这些结果验证了棕榈酰化抑制剂通过降低PD-L1表达而激活体内抗肿瘤免疫细胞活性的假设。
由于目前棕榈酰化的小分子抑制剂缺少对DHHC酶的选择性,因此许杰课题组进行了棕榈酰化竞争性抑制剂的设计尝试。DHHC酶的特异性由底物序列决定,所以PD-L1的被修饰位点附近的多肽序列可能竞争抑制DHHC3对内源性PD-L1的修饰。理论上这种竞争性抑制剂对DHHC成员的选择性较比-BP更强。作者通过一系列实验证明上述竞争抑制剂的设计思路是有效的,并通过设计的PD-PALM多肽降低了肿瘤细胞PD-L1的表达量。在此基础上,今后还可以对PD-PALM进行衍生改造和修饰,以进一步提高其活性和稳定性,增强其成药潜力。
综上,这一研究对PD-L1的棕榈酰化进行了较为深入的功能和机制研究,揭示了PD-L1棕榈酰化影响溶酶体降解的确切途径,设计了以棕榈酰化为靶点的多肽型PD-L1抑制剂,为棕榈酰化相关的机制与转化研究带来启示。
值得一提的是,2018年12月4日,来自美国MD安德森癌症研究中心的洪明奇( Mien-Chie Hung)教授课题组在Cell Research上以Letter形式发表了题为Palmitoylation stabilizes PD-L1 to promote breast tumor growth的论文,首次报道了PD-L1的棕榈酰化修饰以及相关生物学功能研究【3】。
据悉,该论文的通讯作者是许杰研究员,第一作者是姚晗博士,以及共同第一作者兰江博士研究生、李楚舒博士研究生和石虎兵教授。
通讯作者介绍:
许杰,上海交通大学医学院附属仁济医院研究员、博士生导师,博士毕业于比利时布鲁塞尔自由大学,主要从事消化系统肿瘤发生机制与生物治疗靶点的研究,在PD-1/PD-L1肿瘤免疫检查点和p53抑癌通路开展机制和转化研究工作。入选国自然优青、万人计划青年拔尖人才、仲英学者、东方学者等人才计划项目,承担国家重点研发计划课题以及自然科学基金等多项科研课题,兼任BMC Cancer副主编以及Frontiers in Pharmacology专题主编。近年来以通讯作者在Nature Chemical Biology, NatureBiomedical Engineering, Cell Chemical Biology,Gut,JNCI,Cancer Research, NatureCommunications, Cell Reports, Oncogene等期刊发表论文。
制版人:子阳
参考文献:
1、Wang, H., Yao, H., Li, C., Shi, H., Lan, J., Li, Z., ... & Xu, J. (2019). HIP1R targets PD-L1 to lysosomal degradation to alter T cell–mediated cytotoxicity. Nature chemical biology, 15(1), 42.
2、Zhang, J., Bu, X., Wang, H., Zhu, Y., Geng, Y., Nihira, N. T., ... & Wei, W. (2018). Cyclin D–CDK4 kinase destabilizes PD-L1 via cullin 3–SPOP to control cancer immune surveillance. Nature, 553(7686), 91.
3、Yang, Y., Hsu, J. M., Sun, L., Chan, L. C., Li, C. W., Hsu, J. L., ... & Hung, M. C. (2019). Palmitoylation stabilizes PD-L1 to promote breast tumor growth. Cell research, 29(1), 83.
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