帕金森氏病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,患者会出现运动障碍并逐渐恶化,同时也会出现认知和情绪等相关症状,这些都是由中脑多巴胺能神经元丢失导致纹状体多巴胺分泌减少所引起的。现有药物只能暂时加强多巴胺信号传导,以缓解疾病的症状,但同时又可能存在着严重副作用。先前研究表明Nurr1可能与多巴胺能神经元丢失有关,提高Nurr1水平能够提高神经元存活率以缓解帕金森症状,现有的研究结果无论是从基因治疗方面提升Nurr1蛋白水平还是通过设计小分子结合Nurr1以调节其活性都遇到了瓶颈,原因主要是缺乏对Nurr1结构和活性的了解。
基于此,本文团队通过测试发现了一种天然存在的分子5,6-二羟基吲哚(DHI,一种用过量多巴胺处理细胞时产生的物质)可以直接与Nurr1结合并调节其活性,且不需要额外元件辅助激活,并利用细胞和活体斑马鱼模型证明了DHI增强Nurr1的活性,上调参与储存和产生多巴胺的靶基因(VMAT2)。
首先作者利用差示扫描荧光测定法(DSF),这是种常用于识别小分子和蛋白质之间的特定相互作用,直接结合并稳定蛋白质的化合物通常会提高Tm值。作者发现DHI在Nurr1 LBD 的Tm中产生浓度依赖性增加,但与DHI结构相关的5,6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)未出现此现象。
作者又通过表面等离振子共振(SPR)的方法证实DHI通过5个的其中之一的保守半胱氨酸残基与Nurr1 LBD共价结合,实验结果显示DHI与Nurr1的结合在Cys566Thr和Cys465Ala突变体中降低,但在Cys505Thr,Cys534Thr或Cys475Thr突变体中没有降低,表明DHI与Cys566和Cys465结合,又通过X射线晶体学证实DHI与Cys566的特异性结合,以及蛋白质结晶学的方法表征用DHI共结晶Nurr1 LBD的结构以及共价修饰位点。
接下来,作者通过将Gal4DBD(pM-Nurr1-Gal4)或普通的Gal4DBD(pM-Gal4)以及报道质粒(pGL4)共转染入人绒毛膜癌细胞(JEG-3),结果发现DHI能够使产生萤火虫荧光素酶表达产生浓度依赖性增加,从而证明在细胞中DHI能够激发Nurr1活性。
随后为了研究DHI对神经元中Nurr1活性的影响,作者通过对斑马鱼中Nurr1靶基因的转录进行表征,将受精后3天的斑马鱼胚胎暴露于DHI 6小时或24小时后提取RNA进行qRT-PCR分析。在用100μMDHI处理后6h,仅编码多巴胺转运蛋白(vmat2,dat)的基因转录水平明显增加;处理24h后,vmat2表达量仍显著增加,并且酪氨酸羟化酶(th)的表达量也出现明显增加。
在本文中,作者使用生物物理和结构分析等方法发现多巴胺代谢物5,6-二羟基吲哚(DHI)在非规范配体结合口袋内与Nurr1结合,形成Cys566和5,6-吲哚醌的共价加合物。在功能测定中,DHI激发Nurr1活性,驱动控制多巴胺稳态的基因转录,上调多巴胺分泌相关基因的转录,表明Nurr1可受内源代谢物的调节,是多巴胺能神经元氧化应激的传感器。尽管DHI自身不稳定且反应活跃,无法成为可行的候选药物,但它与Nurr1结合的这项发现为药物开发以恢复帕金森病中多巴胺平衡提供了宝贵线索,是一个值得深入研究的重要靶点。
文章作者:WYW
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