十年间肺癌治疗经历了翻天覆地的变化，已经由病理分期指导下的放化疗到以驱动基因为指导的靶向治疗。从2004年开始，EGFR靶点突变的发现，拉开了非小细胞肺癌靶向治疗的序幕，随后ALK、ROS1等靶点的发现及应用促使靶向治疗蓬勃发展。2012年，首次发现Nivo单抗可使NSCLC患者从中获益，现在免疫治疗已经成为肿瘤治疗最具希望的治疗方式，肿瘤成为慢性病已现曙光。
受肿瘤本身的特点和目前的临床诊疗限制，肺癌中70%患者初诊即为晚期，无法获得足够的组织用于检测。在治疗过程中，由于肿瘤的时空异质性问题，需要多次检测匹配精准治疗。此外，目前临床通过影像学和/或肿标进行肿瘤监测/疗评，除了存在灵敏度和特异性不足的问题，还无法得知疾病进展原因。而基于外周血的液体活检，具有独特优势，可以辅助解决这些临床困境。
cfDNA是血液中细胞成分之外的小片段DNA，由细胞凋亡或坏死后释放入血的，肿瘤所释放的DNA称为循环肿瘤DNA（ctDNA，circulating tumor DNA），因此，ctDNA是cfDNA的一部分，ctDNA的含量占比与肿瘤负荷相关，被形象的比喻为“分子CT”。除了代替组织样本检测和评效之外，液体活检ctDNA在肿瘤早筛、疾病分型、治疗决策、疗效监测、肿瘤异质性分析、耐药分析等方面都有研究应用探索。目前液体活检在临床肿瘤的应用方向及进展有以下几点：靶点检测，预测靶向药物疗效，计算肿瘤突变负荷（TMB），预测PD-1/L1抑制剂疗效，监测分子肿瘤负荷，克隆进化分析等。
| 靶点检测，预测靶向药物疗效 |
目前有多个基因检测的平台并有多种方法可以选择，这些平台各自的优势特点如下：DHPLC方法对晚期NSCLC患者行EGFR基因突变检测，灵敏度3%，该检测方法获得欧盟认证；ARMS检测因检测灵敏度高、仪器设备要求低、操作流程及数据分析简单，目前为临床广泛采用的检测技术，且CSCO肺癌诊疗指南作为1类证据推荐采用ARMS方法行EGFR基因突变检测，2014年以后将检测技术更换为灵敏度相对高的ARMS法；微滴数字PCR技术，其灵敏度相对更高，目前仅用于科研；二代测序技术可实现多基因平行检测，检测灵敏度由测序深度决定，既往文献报道当测序深度达1*10^4时，其EGFR基因突变检测灵敏度0.2%。目前，常用的平台为CSCO指南推荐的ARMS检测或数字PCR检测，特别是随着NGS检测技术的兴起和发展，NCCN、CSCO指南也建议临床也选择NGSpanel检测，血浆检测检出限低，组织和血浆检测一致性高，一次检测多基因以筛选更多获益患者。
BENEFIT研究提示血浆ctDNA检测可精准指导靶向治疗，使用多基因NGS检测发现，若除了EGFR突变，同时伴随存在驱动或抑癌基因突变检出，会导致TKI获益时间缩短，提示治疗疗效不佳。在治疗过程中，EGFR敏感突变的存在与否也可以可提示治疗的预后。ADELOS研究对比了4种血浆ctDNA检测T790M的平台，以cobas组织检测作为参照，NGS血浆T790M检测显示出较最高的敏感性和一致性。NGS检测指导精准治疗，疗效分析结果显示，ctDNA液体活检在靶点检测，预测药物疗效方面具有临床指导价值。
| 计算肿瘤突变负荷（TMB），预测PD-1/L1抑制剂疗效 |
随着免疫治疗的兴起为肿瘤患者带来新的希望，但是总体治疗总体有效率低的问题困扰着临床。目前对于免疫治疗疗效预测也是临床上急切需要的指标。多个癌种的综合研究发现TMB跟免疫疗效成正比，TMB一般以肿瘤非同义突变总数量或每1Mb（1兆碱基）的突变数量来表示。虽然，从突变到产生新抗原，每一步都有很大折损，但理论上:TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多，对PD-1/PD-L1抑制剂可能更敏感。在临床上，不经过筛选，确实也看到了NSCLC一部分患者对PD-1/PD-L1抑制剂有效；而肿瘤TMB<1/Mb，几乎不太可能产生新抗原（occasionally），对PD-1/PD-L1抑制剂不敏感。基于肿瘤组织的肿瘤突变负荷（TMB）已被论证与恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、尿路上皮癌等多个实体瘤的免疫检查点抑制剂（ICB）单药疗效正相关。然而，有很多患者没有足够的肿瘤组织可供使用，因此针对基于血液的TMB（bTMB）疗效预测的方法有待展开探索尽管目前未确定TMB值一致地cut-off值。但研究者探索了多个cut-off值，发现无论10、16还是20，都可以看到PFS和OS的获益。且bTMB≥16且PD-L1表达＞50%的患者从Atezolizumab的治疗中获益更最多。在bTMB≥16的人群中，PFS HR为0.57（95%CI： 0.33～0.99），实验组与对照组中位PFS分别为4.2个月和2.9个月，HR为0.57（95%CI：0.33～0.99），中位OS分别为13.0个月和7.4个月。由于bTMB≥16组观察到了更优的PFS获益，最终选择了16为cut-off值。进一步扩大患者人群验证也得到同样的结论。在bTMB≥16人群中，研究观察到了PFS和OS的显著获益，PFS HR为0.65（95%CI：0.47～0.92），OS HR为0.64（95%CI：0.44～0.92），进一步确定了16是bTMB预测Atezolizumab疗效合适的cut-off值。
在2019年NCCN指南中建议进行TMB检测，筛选免疫治疗获益患者。但是，其评估标准还无共识。2019年BMJ一篇review综述中讨论了TMB检测在临床实践中需要考虑的因素，提出目前的建议包括样本类型，是组织样本较多；基因panel覆盖区域应大于0.8 MB（最好大于1 MB）确保报告TMB的信息；TMB计算的需一致性分析，检测panel需与WES/FDA批准的panel的进行一致性分析比较；而cut-off 划分目前无标准等，需要与疗效数据关联确定。在中国人检测数据中可以看出，在不同癌种、不同分期，TMB分布不同，基于bTMB可有效预测免疫检查点抑制剂疗效，表现出良好的阳性预测值和阴性预测值，特别在疗效数据中，直观的看到TMB -H患者ORR高，而TMB-L患者不能获益。
| 监测分子肿瘤负荷 |
已有研究表明，ctDNA水平与肿瘤分期、肿瘤体积大小、转移灶个数及治疗都有关，可以反映肿瘤负荷，即“分子CT”。在肝癌的一项研究中发现，肿瘤大小与ctDNA和肿标相比，相关性更强。
ctDNA 提示肿瘤预后：在肺癌中发现，高ctDNA水平与预后差相关，转移性结直肠癌中也是如此，并且比肿标有更高的灵敏性。
ctDNA可评估术后微小残留病灶（MRD）：一项I～III期40名患者肺癌和54名健康成人的40名患者的255个样本。在94％经历复发的可评估患者中，ctDNA在第一次治疗后血液样本中被检测到，表明可靠地鉴定了MRD。治疗后ctDNA检测，在72％的患者中进行放射学检查，中位数为5.2个月，53％的患者携带与酪氨酸激酶抑制剂或免疫检查点阻滞有利反应相关的ctDNA突变谱可从靶向治疗和免疫治疗中获益。活检液体可以准确地检测肺癌患者的ctDNAMRD，同时为患者提供个性化治疗参考。
术后ctDNA监测肿瘤复发风险：55位女性早期乳腺癌患者，新辅助治疗后手术，监测术后ctDNA的有无评估肿瘤复发风险，发现术后ctDNA与肿瘤复发风险高度相关。
ctDNA与肿瘤疗效和复发相关：93%肺癌患者在监测过程中出现ctDNA阳性（2个以上SNV）其中3名患者，辅助化疗前后，血浆检出SNV数目上升，且3名患者均在术后一年出现了复发，提示ctDNA 分析能够反映辅助化疗耐药。患者术前50天进行PET检测，没有发现脑部病灶；术后血浆中有ctDNA检出；术后54天，临床确诊脑部转移，无其他病灶。该结果提示ctDNA较影像学更灵敏，可能更早提示复发。
ctDNA可监测免疫治疗效果：使用durvalumab治疗的肺癌患者研究显示，用药后6周ctDNA水平降低的患者肿瘤体积变小、治疗获益时间长，提示ctDNA水平与免疫治疗疗效相关。
| 克隆进化分析 |
不同癌种，在不同的发展阶段，肿瘤会具有癌种特异和阶段特异的驱动突变，但不同癌种间也存在共同的驱动事件。BENEFIT研究显示：吉非替尼治疗开始后，第8周EGFR突变消失的患者预后好，动态监测EGFR突变有助于预测预后。血浆出现获得性T790M 突变的中位时间为7.6月(95%CI：6.0～10.0)。从T790M阳性至疾病进展的中位时间为2.0月 (95%CI：2.0～4.9)。但是临床该何时更改治疗方案，一项apple研究对比了吉非替尼治疗EGFR阳性患者分别在影像学和ctDNA提示PD时，更换治疗方案，比较获益时间，目前该研究还在进行中，期待结果。
总之，液体活检目前的主要应用是： 靶点检测，预测靶向药物疗效，ctDNA液体活检特异性好，灵敏度高，有临床价值；计算肿瘤突变负荷（TMB），预测PD-1/L1抑制剂疗效，极具前景，cut off需明确；监测分子肿瘤负荷，ctDNA可评估肿瘤预后、微小残留病灶MRD和复发；克隆进化分析，可以协助临床较早期发现耐药原因。
张洪亮 教授
新疆自治区中医医院肿瘤二科主任，主任医师 、副教授、博士生导师，二级主任医师，兼任新疆医科大学中医学院中西医结合内科教研室主任;新疆自治区中医医院国家药物临床试验机构（GCP)肿瘤学负责人;中国中西医结合学会肿瘤专业委员会副主任委员;中国临床肿瘤学会（CSCO）理事;中华中医药学会肿瘤专业委员会常委;新疆中西医结合学会理事、副秘书长、侯任秘书长;《新疆中医药》杂志编委等。主要从事中西医结合肿瘤防治工作，擅长肺癌、乳腺癌、胃癌等治疗，发表论文百余篇，SCI 6篇，出版专著3部，参编1部
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