DNA错配修复是一个高度保守的细胞修复过程，其主要由MLH1,MSH2,MSH6,PMS2等核心蛋白参与识别并修复DNA在进行复制或重组时出现错配的碱基。微卫星是基因组中不到10个核苷酸的简单重复序列，微卫星不稳定性（MSI, microsatellite instability）是指由DNA 错配修复（MMR, mismatch repair）异常造成DNA在复制和重组过程中发生的碱基错误插入，缺失以及合并，从而导致微卫星序列发生改变的现象【1】。许多肿瘤中都存在MSI现象，结肠癌，胃癌，子宫内膜癌以及卵巢癌中尤为常见【2,3】。MLH1启动子高甲基化造成的体细胞MMR失活往往会导致MSI型癌症发生【1】。MSI与免疫检查点阻断反应之间存在着显著相关性，临床上常利用该特点对MSI型肿瘤进行治疗，但是仍有45-60%的MSI型肿瘤并不会对免疫检查点阻断反应产生应答，并且这种免疫阻断治疗方法存在着一定的毒性。因此，寻找针对MSI型肿瘤的新型治疗方法迫在眉睫。
合成致死（synthetic lethality，SL）是指一类两个遗传事件共同发生，导致有机体或者细胞死亡的遗传作用【4】。研究发现，很多肿瘤细胞内都存在着不同的DNA修复相关基因缺陷，从而使得其余正常的某些特定的蛋白质成为肿瘤细胞赖以生存的根本，而如果这些蛋白的功能进一步受到抑制，则会造成肿瘤细胞死亡。因此，DNA修复途径中潜在着一些合成致死的靶点。针对BRCA1、BRCA2（两种DNA同源重组修复重要蛋白）缺失的肿瘤细胞研发的PARP(poly（ADP-ribose）polymerase，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)抑制剂是第一种成功利用合成致死概念获得批准在临床上使用的抗癌药物。
那么，MSI型肿瘤和DNA损伤修复缺陷之间是否也存在合成致死的关系？
2019年4月10日，来自美国Broad研究所的Adam J. Bass团队和Francisca Vazquez团队合作在Nature上发表了题为WRN helicase is a synthetic lethal target in microsatellite unstable cancers的研究性论文，提出了RecQ DNA解旋酶家族中的WRN是微卫星不稳定（MSI, microsatellite instability）型肿瘤细胞生存所必需的。WRN的解旋酶活性缺失会引起MSI型肿瘤细胞DNA双链断裂（DSBs，double-strand breaks）并促进细胞凋亡以及细胞周期停滞，预示了WRN是MSI型肿瘤的合成致死靶点，为潜在的药物靶向治疗提供帮助。
研究人员首先利用两种独立的大规模肿瘤依赖基因数据集（利用CRISPR-Cas9文库对517株细胞进行筛选的project Achilles和利用RNA干扰文库对398株细胞进行筛选的project DRIVE）筛选以期搜寻MSI型肿瘤相关的基因。同时，利用二代测序技术对细胞微卫星区域内缺失序列的数量和比例量化分析，将细胞系分为三组，分别是MSI，MSS (microsatellite stable，微卫星稳定)，和未明确型。通过基因组规模的功能基因组筛选，研究人员确定了与MSI型细胞系存在最为紧密的依赖关系的基因WRN（在体内编码产生RecQ DNA 解旋酶家族的WRN）。
为了进一步验证这种依赖关系，研究人员设计了WRN靶向sgRNAs分别对5株MSS和MSI细胞系内的WRN进行敲除，发现在MSI细胞系内WRN的沉默会严重影响细胞活性，而反观MSS细胞系则不会出现类似的现象。接着，研究人员开发了针对WRN外显子-内含子连接区域的sgRNA（WRN EIJ sgRNA）使内源性WRN沉默但不会影响外源性的WRN功能。通过在内源性WRN沉默的KM12细胞（MSI型）中外源回补WRN cDNA，研究人员验证了MSI型细胞活力的丧失是由WRN失活造成的。
WRN具有3‘-5’外切酶活性和3‘-5’解旋酶活性，因此在DNA修复，复制以及基因组稳定性的维持等方面发挥着重要作用【5,6】。同样的，研究人员选择在内源WRN沉默的KM12细胞中外源回补WRN外切酶活性丧失突变体（E84A），解旋酶活性丧失突变体（K577M）以及两种酶活性均丧失突变体（E84A/K577M），以确定WRN哪一部分活性发挥作用。结果表明WRN的解旋酶活性而非外切酶活性的丧失会导致外源拯救失败，这也提示WRN解旋酶功能结构域是潜在的治疗靶点。
接下来，研究人员通过小鼠体内异种移植MSI细胞的方法验证了WRN的缺失会显著抑制肿瘤的生长，并且WRN的沉默会影响新生成的来源于MSI型结肠癌病人的器官样体的生长。无论是体内抑或是病人来源模型的实验结果均表明WRN与MSI之间存在合成致死关系，并且WRN是潜在的MSI型肿瘤的治疗靶点。此外，研究人员发现WRN沉默会造成MSI细胞细胞周期停滞和细胞凋亡，并且免疫荧光染色结果表明WRN缺失诱导p53活性应答。进一步的实验发现WRN的沉默会促进MSI细胞内双链DNA断裂，引起DNA修复应答。
为了评估WRN沉默对基因组完整性的影响，研究人员利用端粒荧光原位杂交技术对2株MSI和MSS细胞中期染色体形态进行分析。在MSS细胞中研究人员未观察到特定的端粒缺陷，但是在MSI细胞中，WRN沉默导致了DNA双链断裂和大量的染色体断裂，表明WRN缺失造成DNA双链断裂在MSI细胞中的积累，WRN在MSI细胞中起到了维持基因组稳定性的作用。最后，研究人员对MSI细胞中存在的MMR缺陷和WRN依赖关系进行分析，发现单独的MMR缺陷就可以造成合成致死，这种现象虽然不能完全解释合成致死作用，但也表明随着MSI的累积，基因组的损伤促进了WRN与MSI之间的依赖关系。
总的来说，本研究揭示了在MSI细胞中WRN失活会诱导DNA双链断裂并促进DNA损伤应答，继而促进细胞周期停滞，造成细胞死亡。本研究强调了WRN是MSI型肿瘤细胞中的一个合成致死靶点，拓宽了基于WRN靶向治疗的应用范围，也证明了大规模的癌症数据分析有助于发现肿瘤潜在的弱点和靶向治疗标志物的筛选，从而加快精准治疗的发展。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1102-x
参考文献
1. Kim, T. M., Laird, P. W. & Park, P. J. The landscape of microsatellite instability in colorectal and endometrial cancer genomes. Cell 155, 858–868 (2013).
2. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature 513, 202–209 (2014).
3. Kunitomi, H. et al. New use of microsatellite instability analysis in endometrial cancer. Oncol. Lett. 14, 3297–3301 (2017).
4. Chan, D. A. & Giaccia, A. J. Harnessing synthetic lethal interactions in anticancer drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 10, 351–364 (2011).
5. Swanson, C., Saintigny, Y., Emond, M. J. & Monnat, R. J. Jr. The Werner syndrome protein has separable recombination and survival functions. DNA Repair 3, 475–482 (2004).
6. Rossi, M. L., Ghosh, A. K. & Bohr, V. A. Roles of Werner syndrome protein in protection of genome integrity. DNA Repair 9, 331–344 (2010).
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