2019年4月11日/医麦客 eMedClub/--当癌症从免疫系统中逃逸时，我们的防御系统就变得无能为力。嵌合抗原受体(CAR)T细胞是一种很有前途的免疫治疗策略，通过改造患者的T淋巴细胞，使其识别肿瘤表达的靶分子，从而消除肿瘤。临床试验证明，这种技术非常有效，因此已经批准用于在成人和儿童中治疗血癌(B细胞淋巴瘤和白血病)。
然而，部分患者的复发仍然是一个挑战，并且人们对不同解剖部位中CAR-T细胞相互作用的结果和动力学知之甚少。
近日，一项由巴斯德研究所Philippe Bousso博士领导，及其同事与来自英国曼彻斯特大学和莱顿大学的科学家合作的研究，首次可视化了CAR-T细胞与肿瘤的斗争，开始阐明CAR-T细胞的精确工作原理，以求优化未来的治疗方法。于4月1日在线刊登在国际权威免疫学期刊The Journal of experimental medicine(JEM)上。
利用一种新的高分辨率活体成像技术，他们研究了淋巴瘤小鼠中CAR-T细胞的整体行为，并实时可视化CAR-T细胞与肿瘤之间的相互作用，以及肿瘤死亡(使用一种巧妙的技术，在癌细胞死亡后改变其颜色)。即使某些CAR-T细胞比其他细胞更活跃，他们也证明了CAR-T细胞通常能够在识别目标后25分钟内直接杀死肿瘤细胞。
Philippe Bousso解释说：“基于我们实验数据的数学模拟证实，CAR-T细胞的功效主要是基于它们参与并直接杀死癌细胞，而不是将其他免疫细胞招募到肿瘤部位的能力。”这些模拟还表明，能够浸润骨髓的CAR-T细胞数量对血癌治疗效果起着重要作用。
Philippe Bousso博士（图片来源：PopScreen）
本项研究中，使用源自Eμ-myc转基因小鼠的肿瘤细胞系，其发展出自发的Burkitt样B细胞淋巴瘤。这些细胞表达CD19标记，并且当注射到受体小鼠中时，在骨髓、脾和淋巴结中建立。利用逆转录病毒转导活化的小鼠CD8+ T细胞制备CD19 CAR-T细胞。
作为实时检测肿瘤细胞凋亡的一种方法，Eμ-myc肿瘤细胞中表达了基于基于遗传编码的荧光共振能量转移(FRET)的半胱天冬酶-3活性报告基因。
研究人员发现CAR-T细胞有效诱导肿瘤细胞凋亡，如通过恶性B细胞中的FRET损失所测量的，促使在一天内消除几乎所有肿瘤细胞。在与CAR-T细胞接触后，使用体外延时成像也可以容易地检测肿瘤细胞凋亡。这些结果建立了相关的模型来研究和观察体内CAR-T细胞的细胞毒活性。
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先前使用CD20 CAR-T细胞的研究报道，CAR-T细胞在内源性B细胞存在的情况下未能归巢到骨髓，而是积聚在肺部。骨髓是B细胞淋巴瘤/白血病发展的主要部位。
本次研究使用CD19 CAR-T细胞，还观察到B细胞耗尽或使用B细胞缺陷小鼠促进骨髓中的CAR-T细胞积累。在CAR-T细胞注射的15分钟内，对受体小鼠的肺进行成像，检测到包含CAR-T和B细胞的许多大细胞簇。
这一观察结果表明，CAR-T细胞在进入循环时与B细胞相互作用，导致形成大量细胞聚集体，这些聚集体被困在肺部，阻止它们迁移到肿瘤部位。
鉴于一些B细胞淋巴瘤/白血病的患者可能表现出高循环肿瘤负荷，研究人员接下来试图确定：在已确定的B细胞恶性肿瘤的背景下，循环肿瘤是否也有利于肺中的细胞捕获。
对RAG2 -/- 小鼠用亚致死剂量的辐射调理，然后注射或不注射Eμ-myc细胞。一旦循环肿瘤细胞在血液中可检测到(通常10天后)，立即使用CAR-T细胞进行治疗。
结果发现，在荷瘤小鼠中，归巢到骨髓的CAR-T细胞与对照组相比大量减少。这一现象与肺中CAR-T细胞和肿瘤细胞的聚集体快速积累有关。相反，这些大的细胞聚集体不存在于缺乏CD19表达细胞的RAG2 -/- 小鼠的肺中。
为了确认这些大的细胞聚集体在循环中形成，研究人员在初始接受者中一并注射肿瘤、CAR和对照T细胞，并在15分钟后对肺进行成像。在这个早期的时间点，由CAR-T细胞和肿瘤细胞组成的聚集体已经聚集在肺微循环中。
在这些实验中，CAR-T细胞在肺中积累的数量是对照CD8+ T细胞的两倍，表明由循环肿瘤诱捕的细胞依赖于CAR介导的相互作用。尽管这种诱捕现象可能是短暂的，但结果表明，B细胞的存在限制了CAR-T细胞在骨髓中植入至少3天。
为了测试循环靶标(B细胞和肿瘤)捕获CAR-T细胞的功能结果，他们考虑使用CD20抗体减少循环靶标。重要的是，研究中肿瘤细胞表达的CD20水平非常低，并且抗CD20治疗对B细胞没有耗尽。通过特异性地消耗B细胞，这种策略能够以最小的直接抗肿瘤效果去除一部分循环靶标。CAR-T细胞和抗CD20治疗的结合显著降低了肿瘤负荷，并与中度延长的生存率相关。
综上，循环靶标(B细胞和肿瘤细胞)可能通过竞争骨髓肿瘤细胞和/或物理性地将CAR-T细胞隔离在肺中，代表了CAR-T细胞治疗的实质性障碍。
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根据上述对CAR-T细胞移植的研究结果，CAR-T细胞被移植到预处理的淋巴瘤小鼠体内(此时疾病主要局限于骨髓，循环肿瘤最小)，以发挥较好治疗效果。
使用活体双光子成像，发现转移2次后，在骨髓中可检测到CAR-T细胞和对照未转导的激活的CD8+ T细胞(视频1)。值得注意的是，凋亡肿瘤细胞的存在很大程度上仅限于用CAR-T细胞处理的受体。
视频1: 对照T细胞处理淋巴瘤小鼠的活体骨髓成像（来源：JEM）
大多数肿瘤细胞凋亡事件(73％)发生在与CAR-T细胞直接细胞接触的背景下(视频2和3)。
视频2: 骨髓中CAR-T细胞有效且快速地杀死B细胞肿瘤-例1（来源：JEM）
视频3: 骨髓中CAR-T细胞有效且快速地杀死B细胞肿瘤-例2（来源：JEM）
值得注意的是，CAR-T细胞的转移也增加了间接杀伤事件数量的6.5倍，其中肿瘤细胞在没有与CAR-T细胞的任何可检测的相互作用的情况下经历细胞凋亡(视频4)。
视频4: B细胞肿瘤经历细胞凋亡而没有明显与CAR-T细胞接触的实例（来源：JEM）
虽然不能排除CAR-T细胞在开始成像之前与这些肿瘤细胞相互作用，但这些间接细胞凋亡事件可能反映了内源性效应物活性的增强和/或CAR-T细胞衍生细胞因子的活性。
总体而言，杀伤是快速和动态的，因为CAR-T细胞在约25分钟内经历其靶标结合、杀死和脱离。这表明，尽管表达了高亲和力的受体，CD19 CAR-T细胞能够迅速分离并快速恢复运动，这一特性有利于连续追踪。
与此观点一致，在少数情况下，观察到单个CAR-T细胞杀死相邻肿瘤细胞的证据(视频5)。
视频5: CAR-T细胞连续杀死骨髓中相邻的肿瘤细胞（来源：JEM）
为了进一步证实CAR-T细胞的高杀伤能力，我们将它们的活性与在最有利的背景下分析的常规CTL进行比较。在体外和体内，与OT-I T细胞相比，CAR-T细胞抑制了相似的(如果不是更高的)抗肿瘤活性。
总之，结果表明，CAR-T细胞的细胞毒活性在肿瘤消除中起主要和直接作用，体内快速杀伤动力学是CAR-T细胞的标志。
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虽然成像实验显示，CAR-T细胞介导的肿瘤杀伤是一种高度快速的事件，但并非所有CAR-T细胞相互作用都介导靶标杀死。平均而言，约20％的CAR-T细胞在成像期间参与杀伤事件。观察到一部分CAR-T细胞与其靶标相互作用和脱离而不引发细胞凋亡(视频6)。
视频6: CAR-T细胞与肿瘤细胞形成长期相互作用而不诱导其凋亡的实例（来源：JEM）
这种结果的异质性可能源于CAR-T细胞间细胞毒性潜能的差异(如细胞毒性颗粒含量的差异)。或者，与靶标接触后CAR-T细胞信号传导的差异可能导致不明确的功能后果。
为了检验后一种假设，研究人员关注的是Ca2+信号，这些信号对于结合物形成和细胞毒性颗粒的释放都很重要。
(视频7和8)一些CAR-T细胞在与肿瘤细胞接触时表现出强烈的钙响应，而其他CAR-T细胞尽管形成长时间接触但反应差。此外，虽然杀伤与CAR-T细胞中强烈的钙升高相关，但是一些相互作用导致可检测的钙响应而没有明显杀伤。
视频7: CAR-T细胞与肿瘤细胞相互作用时具有高钙响应的实例（来源：JEM）
视频8: CAR-T细胞与肿瘤细胞相互作用时具有弱钙响应的实例（来源：JEM）
为了测试在一些CAR-T细胞中缺乏信号传导，是由于CAR识别中的缺陷，还是钙途径中更普遍的阻断，研究人员设计了一种通过体内内源性TCR刺激CAR-T细胞的实验。
结果支持这样的观点：即无反应的CAR-T细胞表现出改变的CAR介导的信号转导，其不是源自钙动员的全局阻断。
总之，这些实验揭示了CAR-T细胞与肿瘤相互作用过程中信号的广泛异质性，并且这些相互作用影响了杀伤结果。
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间接凋亡事件的发生到底在肿瘤消退中起多大作用？
研究人员在观察到，CAR治疗后第5天分析骨髓时，绝大多数肿瘤细胞已被消除；在第2天和第5天之间，CAR-T细胞的密度增加了约10倍；凋亡肿瘤细胞的百分比在第2天和第5天之间增加，并且与骨髓中存在的CAR-T细胞的百分比大致相关。
总之，活体成像和数学模型支持CAR-T细胞可以完全依赖其直接的细胞毒性活性，在几天内清除骨髓中的绝大多数肿瘤细胞，而不是通过招募和激活其他效应因子。
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CAR-T细胞处理的受体小鼠显示出显著延长的存活但最终复发。到治疗后第21天，骨髓被肿瘤细胞侵入。此时，在骨髓中几乎没有检测到CAR-T细胞和极少数的凋亡肿瘤，表明没有持续的细胞毒性免疫反应。治疗后4周，骨髓和淋巴结中基本检测不到CAR-T细胞。
这与某些患者中观察到的相似，其复发肿瘤中检测到CD19阴性肿瘤的生长，但有趣的是，抗原丢失变异出现在骨髓中，而不是淋巴结中，在淋巴结中肿瘤细胞保持CD19阳性。
因此，不同的免疫压力水平可能取决于解剖学部位。
基于这种想法，研究人员比较了CAR-T细胞介导淋巴结和骨髓中转移的CD19 + 脾细胞杀伤的能力。尽管CAR-T细胞在淋巴结中存在较高的密度，但是CD19+细胞从骨髓中有效地耗尽，但不是从淋巴结中消除。
一致地，他们发现骨髓细胞在淋巴结中表达高水平的PD-L1而在骨髓中不表达，表明组织微环境的差异可能导致CAR-T细胞活性的差异。
上述结果表明，CAR-T细胞消失、抗原丢失变异的出现和免疫特权生态位中的肿瘤逃逸可能在初始接近完全消除阶段后导致肿瘤复发。
注：肿瘤免疫编辑假说(cancer immunoediting hypothesis)，肿瘤细胞会逐渐发展出多种机制来避开宿主免疫系统的监视；比如通过遗传学或表观遗传学改变来降低被免疫细胞识别的可能性，通过激活各种与肿瘤发生相关的分子信号通路来增强癌细胞对免疫杀伤细胞的耐受力，通过下调相关肿瘤抗原的表达，和通过促进低免疫原性或免疫抑制的肿瘤微环境的形成。
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总之，这次结果确定了不同解剖部位中CAR-T细胞接触结果的巨大差异，影响了移植、抗肿瘤活性和肿瘤免疫编辑。在解剖学和显微解剖学水平上定义相关的免疫细胞相互作用是理解肿瘤免疫治疗机制和确定最佳治疗策略的重要一步。
Philippe Bousso总结道：“通过阐明CAR-T细胞在作用中的优缺点，该研究为开发和优化患者CAR-T细胞的活性开辟了新途径。”
参考出处：
https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190408101126.htm
http://jem.rupress.org/content/early/2019/03/29/jem.20182375/tab-figures-data
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