摘 要:目的 探讨水飞蓟宾及同分异构体的体外抗菌谱及水飞蓟宾与临床常用抗生素的联合抑菌效应。方法 用微量肉汤稀释法测定水飞蓟宾及同分异构体对临床感染常见细菌的6种标准菌株和6种临床分离菌株(74株)的最低抑菌浓度(MIC)。用平板菌落计数法测定不同质量浓度水飞蓟宾对6种标准菌株的生长抑制曲线。用棋盘微量肉汤稀释法进行水飞蓟宾与临床常用抗生素的联合药敏试验,计算联合抑菌指数(FIC),判定水飞蓟宾与抗生素的联合抑菌效应。结果 水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌标准菌株的MIC为50~400 μg/mL,对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌标准菌株的MIC均>400 μg/mL;对表皮葡萄葡萄球菌临床分离菌株的MIC分别为100、200、400、>400 μg/mL,对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌临床分离菌株的MIC分别为400、>400 μg/mL;对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株的MIC均>400 μg/mL。水飞蓟宾其他同分异构体对6种标准菌株的MIC为≥400 μg/mL。水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌标准菌株的生长曲线都有明显抑制作用,抑制效果随药物质量浓度增加而增加,对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌标准菌株的生长曲线无影响。水飞蓟宾与青霉素/红霉素联用对革兰阳性试验菌的FIC以0.5<FIC≤1和1<FIC≤2为主,水飞蓟宾与环丙沙星或庆大霉素联用对革兰阴性试验菌的FIC以FIC>2或1<FIC≤2为主。结论 水飞蓟宾对革兰阳性菌有较好的抑菌活性,其中对表皮葡萄球菌抑菌活性最强。水飞蓟宾的抑菌活性明显高于其他同分异构体。水飞蓟宾与青霉素/红霉素联用主要为相加和无关作用,与环丙沙星或庆大霉素联用主要为拮抗或无关作用。
1 材料
1.1 药物与试剂
、水飞蓟宁(质量分数>98%,批号S-112-170418)、异水飞蓟宾(质量分数>98%,批号Y-138-161201)、水飞蓟亭(质量分数>97%,批号S-111-170418)均购自成都瑞芬思生物科技有限
1.2 菌株
1.2.1 标准菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228、粪肠球菌ATCC29212、屎肠球菌ATCC19434、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853,购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心-菌种保藏中心。
1.2.2 临床分离菌株 金黄色葡萄球菌15株、表皮葡萄球菌10株、粪肠球菌4株、屎肠球菌15株、大肠埃希菌15株、铜绿假单胞菌15株,均收集于四川省中医院。
1.3 仪器
台式恒温振荡培养器购自上海跃进医疗器械有限公司。
2 方法
2.1 水飞蓟宾及同分异构体药液配制
用二甲基亚砜将水飞蓟宾及同分异构体样品溶解并配成80 mg/mL的母液,滤过除菌后4 ℃保存备用。使用时先用无菌MH肉汤将母液稀释100倍,再用MH肉汤进行倍比稀释为800、400、200、100、50、25、12.5 μg/mL。
2.2 抗生素溶液配制
2.3 细菌悬液制备
将菌株复苏于血琼脂平板上,37 ℃培养24~48 h,挑取单个纯菌落接种于无菌MH肉汤培养基中,37 ℃(100 r/min)振摇培养至对数生长期,用无菌MH肉汤稀释菌悬液至0.5麦氏浊度(1.5×108 CFU/mL),再用MH肉汤调节菌液浓度为1.0×106~1.0×107 CFU/mL。
2.4 MIC测定
采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定各受试样品的MIC。
2.4.1 水飞蓟宾及同分异构体对标准菌株的MIC测定 取96孔板,每孔加入100 μL菌悬液和100 μL不同质量浓度的供试药液(水飞蓟宾、异水飞蓟宾、无菌MH肉汤)。实验重复3次,取平均值。
2.4.2 水飞蓟宾对临床分离菌株的MIC测定 按“2.4.1”项方法操作测定。
2.4.3 抗生素对标准菌株和临床分离菌株的MIC测定 革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌)选用青霉素、红霉素,革兰阴性菌(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌)选用庆大霉素、环丙沙星。按“2.4.1”项方法操作测定。
2.5 水飞蓟宾对标准菌株的生长抑制曲线检测
取96孔板,每孔加入100 μL菌悬液和100 μL不同质量浓度的水飞蓟宾药液,使水飞蓟宾终质量浓度分别为0.5 MIC、1 MIC、2 MIC;菌阳性对照组用无菌MH肉汤替代药液(菌悬液+无菌MH肉汤)。放37 ℃孵育箱中培养,分别于培养0、2、4、6、8、10、12、14、16 h取样进行平板菌落计数(按国标GB/T5750.12-2006)。将菌悬液按10倍递增稀释后,取目标浓度菌悬液1 mL加入一次性无菌平皿,再加入15 mL 50 ℃左右营养琼脂,立即混匀,待凝固后于37 ℃培养18~24 h,肉眼观察并记录每个平皿的菌落形成单位(colony forming unit,CFU)。以菌落数为30~300的平板,计算每毫升原始样品中所含细菌总数(1 mL原菌悬液中的活菌数=全平板CFU×稀释倍数),每个浓度菌液同时做3个平行平板,CFU取3个平板的均值。当空白对照(只加无菌MH肉汤+营养琼脂,不加菌悬液)平板上无细菌生长时,实验结果有效。以菌落总数为纵坐标,培养时间为横坐标绘制生长抑制曲线。
2.6 水飞蓟宾与抗生素对标准菌株和临床分离菌株的联合药敏实验[15]
2.7 数据统计学分析
统计学处理采用SPSS 23.0统计软件,计数资料以百分比表示。菌种间MIC值分布的总体比较采用Kruskal-WallisH秩和检验,两两比较采用单因素方差分析。FIC值分布的比较采用独立样本χ2检验,两两比较采用χ2分割法。
3 结果
3.1 水飞蓟宾及同分异构体对标准菌株的MIC
结果见表1。水飞蓟宾对革兰阳性菌标准菌株的MIC为50~400 μg/mL,对表皮葡萄球菌表现出最强的抑菌活性,MIC值为50 μg/mL。水飞蓟宾对革兰阴性菌标准菌株的抑菌效果明显低于革兰阳性菌,MIC值>400 μg/mL;在水飞蓟宾的同分异构体中,仅异水飞蓟宾表现出对表皮葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌标准菌株有一定的抑菌活性(MIC为400 μg/mL)。水飞蓟宾的抑菌活性明显高于其同分异构体。
3.2 水飞蓟宾对临床分离菌株的MIC
结果见表2。水飞蓟宾对表皮葡萄球菌临床分离菌株的MIC值分布为>400、400、200、100 μg/mL,对应菌株占比分别为20.0%、40.0%、20.0%、20.0%;对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌临床分离菌株的MIC值分布为>400、400 μg/mL;对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株的MIC值均>400 μg/mL。表皮葡萄球菌的MIC值分布与其他测试菌种比较,差异显著(P<0.05)。
3.3 抗生素对标准菌株和临床分离菌株的MIC
3.4 水飞蓟宾对标准菌株的生长抑制曲线检测结果
结果见图1。对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌,培养液中水飞蓟宾浓度为0.5 MIC时菌体繁殖速度减慢;当药物浓度为1 MIC或2 MIC时菌体繁殖速度受到明显抑制,在培养的16 h内菌体浓度与初始浓度相比基本无变化。大肠埃希菌和铜绿假单胞菌生长曲线不受水飞蓟宾影响,在培养的16 h内与对照组的菌体数量及繁殖速度基本一致。
3.5 水飞蓟宾与临床常用抗生素对标准菌株的联合抑菌效应
FIC值结果见表5。水飞蓟宾与青霉素联合,对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌有相加作用,对屎肠球菌和粪肠球菌是无关作用。水飞蓟宾与红霉素联合,对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌分别为协同和相加作用,对屎肠球菌和粪肠球菌是无关作用。水飞蓟宾与环丙沙星联合,对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均为拮抗作用。水飞蓟宾与庆大霉素联合,对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均为无关作用。
3.6 水飞蓟宾与临床常用抗生素对临床分离菌株的联合抑菌效应
FIC值结果见表6和7。水飞蓟宾与青霉素联合,对表皮葡萄球菌和粪肠球菌的FIC值分布差异显著(P<0.01),对表皮葡萄球菌主要是相加作用,对粪肠球菌主要是无关作用;菌种间FIC值分布的其余两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。水飞蓟宾与红霉素联合,对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及屎肠球菌的FIC值分布差异均无统计学意义(P>0.05)。水飞蓟宾与环丙沙星联合,对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的FIC值分布差异均无统计学意义(P>0.05);水飞蓟宾与庆大霉素联合,对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的FIC值分布差异均无统计学意义(P>0.05)。
水飞蓟宾与青霉素联合对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的FIC值分布,与水飞蓟宾与红霉素联合对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的FIC值分布比较,差异无统计学意义(P>0.05)。水飞蓟宾与环丙沙星联合对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的FIC值分布,与水飞蓟宾与庆大霉素联合对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的FIC值分布比较,差异显著(P<0.05),水飞蓟宾与环丙沙星联合对这2种细菌的联合抑菌效应均以拮抗为主,水飞蓟宾与庆大霉素联合对这2种细菌的联合抑菌效应均以无关为主。
4 讨论
抗生素滥用在医疗、食品安全、动物养殖和环境等方面引起的问题日趋严重。寻找并应用其他抗菌物质控制耐药性细菌或用于食品防腐逐渐引起关注。从天然植物中寻找抗菌资源,筛选抗菌药物越来越受到国内外学者的重视[16]。近年来水飞蓟素的抗菌活性逐渐引起了人们的关注[17-21],但大多数研究是关于水飞蓟素混合物,而对单体的抑菌活性、抑菌谱及其与抗生素联合抑菌效应报道极少。
本实验结果显示,水飞蓟宾对临床常见感染细菌的抑菌活性明显高于其他同分异构体(异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁),表明水飞蓟宾为水飞蓟素的主要抑菌活性成分。黄酮类化合物的抑菌活性具有构效关系,分子中的电荷密度、A环羟基化与亲脂性取代基团能增强抑菌活性,分子结构中较多酚羟基,可与蛋白质、酶等以氢键结合而使其失去活性,从而起到抑菌的作用[6,11]。水飞蓟宾对革兰阳性试验菌的抑菌活性显著高于革兰阴性试验菌,这可能与细胞壁结构差异有关,水飞蓟素(宾)可破坏革兰阳性菌-金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的细胞壁[12,18]。水飞蓟宾对表皮葡萄球菌的抑菌活性最强,标准菌株和临床分离菌株的MIC值分别为50 μg/mL和100~400 μg/mL;对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的抑菌效果不佳,这些标准菌株和临床分离菌株的MIC值分别为400 μg/mL和≥400 μg/mL。Evren等[19]报道水飞蓟素对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌和粪肠球菌的MIC值为60~120 μg/mL,水飞蓟宾占水飞蓟素的60%~70%,据此可推出水飞蓟宾对这些细菌的MIC值应低于60~120 μg/mL。水飞蓟宾单体对这些细菌的MIC值明显高于水飞蓟素,这可能与水飞蓟素为含多种成分的混合物,存在协同抑菌作用及药物纯度有关。文献报道[6]甘草乙醇浸膏中甘草酸和甘草渣总黄酮具有协同抑菌作用。鉴于上述结果,本实验选用抑菌活性最好的水飞蓟宾进行后续实验。
本实验结果显示,水飞蓟宾对多重耐药菌的抑菌活性明显低于敏感菌株。这与Jung等[20]的研究结果存在较大差异。与标准菌株比较,水飞蓟宾对临床分离菌株显示较低的抑菌活性,在相同菌种临床分离菌株间MIC也存在较大差异,这可能主要是因为菌株间存在不同耐药机制,如细菌同时产生多种抗生素水解酶、钝化酶、修饰酶,或存在外排泵系统,或药物作用靶位改变等,这些都可使药物的抑菌作用降低。
本实验结果表明,水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的生长都有明显抑制作用,抑制效果随药物质量浓度的增加而增加。水飞蓟宾对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的生长没有抑制作用。这也验证了水飞蓟宾能抑制革兰阳性菌生长,而对革兰阴性菌生长无抑制作用。
临床上中西药联合应用较为广泛,中药和化学药联合应用可取长补短利于疾病治疗、减少耐药菌发生、降低或减少毒副作用。联合药敏实验结果表明,对革兰阳性试验菌,水飞蓟宾与青霉素/红霉素联合抑菌效应以相加和无关作用为主,无协同和拮抗作用。水飞蓟宾与青霉素/红霉素联合用药,对青霉素/红霉素耐药的菌株,不能降低细菌对青霉素/红霉素的耐药程度和使其耐药性逆转;但对青霉素/红霉素敏感的菌株,可降低青霉素/红霉素的临床用药剂量,降低或减少毒副作用与不良反应。对革兰阴性试验菌,水飞蓟宾与环丙沙星联合抑菌效应以拮抗作用为主,无协同和相加作用。水飞蓟宾与环丙沙星联合用药,不仅不能降低环丙沙星耐药菌株对环丙沙星的抗药性,反而增加其抗药性;对环丙沙星敏感菌株,需增加环丙沙星的临床用药剂量,更易引起毒副作用或不良反应。水飞蓟宾与庆大霉素联合抑菌效应以无关作用为主,少数可产生拮抗作用,无协同和相加作用。水飞蓟宾与庆大霉素联合用药,不能降低庆大霉素耐药菌株的耐药程度和使其耐药性逆转,有可能增强其抗药性;对庆大霉素敏感菌株,不能降低庆大霉素的临床用药剂量,致水飞蓟宾的无意义用药。但水飞蓟宾可减少庆大霉素产生的活性氧,减轻其引起的肾脏毒性[22]。
参考文献(略)
来 源:谢思露,赵茂吉,杨朝国. 水飞蓟宾及其同分异构体的抑菌谱及其与抗生素联合抑菌效应探讨 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1641-1648.
联系客服