丹参酮IIA对乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响及相关机制研究

摘 要：目的  探讨丹参酮II_A对乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响及相关机制。方法  分别用丹参酮II_A、阿霉素、阿霉素＋丹参酮II_A干预人乳腺癌MCF-7和阿霉素耐药的MCF-7（MCF-7/dox）细胞，采用MTS法检测细胞增殖率，流式细胞术检测细胞凋亡率，划痕实验观察细胞迁移能力，Westernblotting法检测腺瘤样结肠息肉易感蛋白（APC）、β-catenin、钙黏附蛋白E（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9蛋白的表达。结果 丹参酮II_A能明显增强阿霉素对MCF-7和MCF-7/dox细胞的增殖抑制、迁移抑0.05），β-catenin蛋白表达水平显著提高（P＜0.05）；与单用阿霉素比较，阿霉素与丹参酮II_A联合使用能明显上调MCF-7及MCF-7/dox细胞内APC及E-cadherin表达水平（P＜0.05），下调β-catenin、MMP-2及MMP-9蛋白表达水平（P＜0.05）。结论 APC/β-catenin信号通路参与了乳腺癌细胞阿霉素耐药的发生；丹参酮II_A能够通过调控APC/β-catenin信号通路增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性。

乳腺癌已经成为严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。目前乳腺癌的治疗仍然以手术为主，化疗、放疗和内分泌疗法为辅。随着抗癌药物的不断问世，使化疗在乳腺癌的综合治疗中占有重要的地位。阿霉素作为乳腺癌常用一线化疗药物，在具有良好抗肿瘤效果的同时也产生很多的毒副作用，如造血抑制、免疫力降低、心脏毒性等，其中以心脏毒性最为明显。不仅如此，随着用药时间的延长，患者也容易对阿霉素甚至与其结构无关、作用机制不同的其他化疗药物产生耐药性^[1]。因此，如何在增加阿霉素化疗敏感性的同时降低其毒副作用成为研究热点。丹参酮II_A为我国传统中药丹参的主要有效成分，研究显示丹参酮II_A不仅具有良好的心血管保护作用^[2-3]，同时还能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰肿瘤细胞周期及相关信号转导通路等起到抗肿瘤作用^[4-8]。由于阿霉素对心肌的毒副作用正是丹参酮II_A参与治疗的重点之

1  材料

1.1  细胞

1.2  药材与试剂

DMEM高糖培养基、青链霉素均购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于德国Serana公司；丹参酮II_A粉末（批号JL1806010006，质量分数≥98%）购于上海江莱生物科技公司，DMSO溶解分装后，于−20 ℃贮存；阿霉素粉末（批号02130102，质量分数≥98%）购于山西普德药业股份有限公司，无菌水溶解分装后，放−20 ℃保存；磷酸盐缓冲液（PBS）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；MTS细胞增殖试剂盒购于美国Bio Vision公司；细胞凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司；小牛血清白蛋白购于北京Solarbo科技有限公司；GAPDH、腺瘤样结肠息肉易感蛋白（APC）、β-catenin、钙黏附蛋白E（E- cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9抗体均购于沈阳万类生物科技有限公司。

1.3  仪器

CO₂孵育箱购于Thermo科技有限公司；酶标仪购于BioTek公司；流式细胞仪购于美国BD公司；数显恒温水浴箱购于江苏金坛医疗厂；倒置显微镜购于徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；立式压力蒸汽灭菌器购于上海实业博迅有限公司。

2  方法

2.1  细胞培养

MCF-7和MCF-7/dox细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、5% CO₂孵箱中培养，根据细胞生长情况，每隔1～2天换1次液体，待细胞长满时进行传代或冻存。MCF-7/dox细胞在培养过程中需用3.68 μmol/L的阿霉素培养来维持耐药性，于实验前1周对其进行脱药培养。

2.2  MTS法检测丹参酮II_A对MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖的影响

取2～3次传代后对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶进行消化制成细胞密度为1×10⁵个/mL的悬液，以每孔100 μL铺于96孔板中，设空白组、对照组和丹参酮II_A各浓度组，于37 ℃、5% CO₂的环境中培养24 h，吸去板中旧液，加入事先用无血清DMEM高糖培养基稀释的丹参酮II_A溶液，使其终浓度为0.035、0.070、0.140、0.210、0.280、0.350、1.700、3.500、17.000 μmol/L，继续培养24 h后，采用MTS法检测细胞增殖率。于490 nm检测吸光度（A）值。

细胞增殖率＝(A_实验－A_空白)/(A_对照－A_空白)

因丹参酮II_A本身具有抗肿瘤作用，为了更好地评估其对乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性的影

2.3  MTS法检测丹参酮II_A对阿霉素抑制乳腺癌MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖的影响

取2～3次传代后对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶进行消化制成细胞密度为1×10⁵个/mL的悬液，以每孔100 μL铺于96孔板中，于37 ℃、5% CO₂的环境中培养24 h，分别以阿霉素0.46、0.92、1.84、2.76、3.68、4.60 μmol/L和阿霉素各浓度联合丹参酮II_A 0.07 μmol/L处理MCF-7细胞；分别以阿霉素3.68、7.36、14.72、22.08、29.44、44.16 μmol/L和阿霉素各浓度联合丹参酮II_A 0.07 μmol/L处理MCF-7/dox细胞，作用24 h后，采用MTS法检测细胞增殖率并计算增敏倍数。

增敏倍数＝IC_{50阿霉素-联合用药前}/IC_{50阿霉素-联合用药后}

2.4  流式细胞术检测丹参酮II_A对阿霉素抑制乳腺癌细胞凋亡的影响

取2～3次传代后对数生长期MCF-7和MCF-7/ dox细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以每孔3×10⁵个细胞铺于6孔板中，于37 ℃、5% CO₂的环境中培养24 h，分别以阿霉素3.68μmol/L、阿霉素3.68 μmol/L联合丹参酮II_A 0.07 μmol/L处理MCF-7和MCF-7/dox细胞，另设不加药物的对照组，作用24 h后用0.25%胰酶消化，PBS洗2遍，1 Iodide混匀，室温避光15 min，于1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

2.5  划痕实验检测丹参酮II_A对阿霉素抑制乳腺癌细胞迁移的影响

取2～3次传代后对数生长期MCF-7和MCF-7/dox细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数铺于6孔板中，于37 ℃、5% CO₂环境中培养，以第2天长成单层为宜。待细胞长成单层，用100 μL枪头在每个孔中划“+”字，弃去旧液，划落细胞用PBS洗净，每孔中加入2 mL不含血清的DMEM高糖培养基，用封口膜封好，在普光显微镜下进行加药前的拍照，拍照时让划痕统一呈垂直方向。拍照后分别以阿霉素、阿霉素联合无毒剂量丹参酮II_A处理MCF-7和MCF-7/dox细胞，且2种细胞各留1组不加药作对照组。因为划痕实验要保持一定的细胞密度，所以选择阿霉素浓度为IC₁₀浓度，MCF-7、MCF-7/dox细胞选用的阿霉素浓度分别为0.18、9.0 μmol/L，于加药后24、48 h后重新进行拍照。

2.6  Western blotting检测APC、β-catenin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平

取培养于10 cm培养皿内对数生长期的MCF-7和MCF-7/dox细胞，用0.25%胰酶消化后按1∶2传代，于第2天进行加药处理。设对照组、阿霉素（3.68 μmol/L）组、阿霉素（3.68 μmol/L）联合丹参酮II_A（0.07 μmol/L）组，药物作用24 h后，收样于EP管中，5 500 r/min离心4 min，加入裂解液涡旋混匀后于冰上静置30 min裂解，置于4 ℃、12 000 r/min离心25 min，吸取上清即为总蛋白，对收集的各组蛋白进行定量，使其终质量浓度相同。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜上，BSA封闭

2.7  统计学分析

实验数据采用SPSS 17.0软件进行处理分析，计量资料以表示，两独立样本进行比较时采用t检验，检验水准为α＝0.05。

3  结果

3.1  丹参酮II_A对MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖的影响

如图1所示，浓度不高于0.07μmol/L的丹参酮II_A对MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖无影响。当丹参酮II_A浓度高于0.07 μmol/L时，随着丹参酮II_A浓度的增加，对乳腺癌细胞增殖的抑制作用越明显。因丹参酮II_A本身具有抗肿瘤作用，为了更好地评估其对阿霉素抗乳腺癌细胞活性的影响，应排除丹参酮II_A本身的抗肿瘤作用，因此后续选用丹参酮II_A对MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖没有影响的无毒剂量（临界浓度）0.07 μmol/L进行实验。

3.2  丹参酮II_A对阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/ dox细胞增殖的影响

如图2所示，与单用阿霉素相比，阿霉素与丹参酮II_A联用会更明显地抑制MCF-7和MCF-7/dox细胞增殖。在MCF-7细胞中，丹参酮II_A将阿霉素的化疗敏感性提高到1.40±0.16倍，在MCF-7/dox细胞中，丹参酮II_A将阿霉素的化疗敏感性提高到1.78±0.09倍。与阿霉素敏感的MCF-7细胞比较，丹参酮II_A提高MCF-7/dox细胞化疗敏感性的作用更明显（P＜0.05）。

根据阿霉素对MCF-7细胞的IC₅₀选取阿霉素浓度3.68 μmol/L进行后续实验。

3.3  丹参酮II_A对阿霉素诱导MCF-7和MCF-7/ dox细胞凋亡的影响

如图3所示，与单用阿霉素相比，阿霉素与丹参酮II_A联合使用会更明显诱导MCF-7和MCF-7/dox细胞凋亡，其中以诱导早期凋亡作用最为明显（P＜0.05）。

3.4  丹参酮II_A对阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/ dox细胞迁移的影响

如图4所示，与单用阿霉素比较，阿霉素与丹参酮II_A联合使用明显抑制MCF-7和MCF-7/dox细胞的迁移。在阿霉素敏感的MCF-7细胞中，药物作用24 h后对细胞迁移抑制作用不明显，48 h后才会明显抑制细胞迁移（P＜0.05）；而在MCF-7/ 0.05）。

3.5  丹参酮II_A对MCF-7和MCF-7/dox细胞中APC、β-catenin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

如图5所示，与阿霉素敏感的MCF-7细胞比较，APC蛋白在MCF-7/dox细胞中表达水平显著降低（P＜0.05），β-catenin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），说明APC/β-catenin信号通路参与了MCF-7/ dox细胞对阿霉素耐药的发生。为进一步探讨丹参酮II_A增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗敏感性是否与APC/β-catenin信号通路有关，检测了MCF-7和MCF-7/dox细胞中APC、β-catenin、E-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。结果表明，与单用阿霉素比较，阿霉素与丹参酮II_A联合使用会明显下调MCF-7及MCF-7/dox细胞中β-catenin、MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平（P＜0.05），上调MCF-7及MCF-7/dox细胞中APC、E-cadherin蛋白的表达水平（P＜0.05）。

4  讨论

虽然乳腺癌的治疗已取得了很大进展，但是乳腺癌患者的死亡率仍在逐年增加，这与乳腺癌细胞的多药耐药性密切相关。阿霉素作为蒽环类药物的重要代表，已成为乳腺癌化疗的一线用药，然而，随着化疗周期延长，一方面乳腺癌细胞容易对阿霉素甚至对其他结构不同、作用机制不同的化疗药物产生耐药性，导致乳腺癌化疗失败、复发转移；另一方面，阿霉素也会对机体产生许多毒副作用，其中以心脏毒性最为严重，从而限制了其临床应用。这虽然降低了阿霉素的用药剂量、减轻其毒副作用和弥补了其耐药问题，但也因此增强了其他化疗药物的毒副作用，因此，寻找一种既能增强乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性又能减轻其所带来的毒副作用的化疗增敏剂亟待解决。理想的化疗增敏剂应具有安全、毒副作用小或对机体有保护作用、具有一定的抗肿瘤作用等优势。丹参酮II_A是丹参的主要有效成分，因其具有较好的心血管保护作用，已被制备成滴丸、胶囊、注射液等，用于缺血性心脏病的治疗^[14-15]。现代药理学研究显示，丹参酮II_A不仅具有心血管保护作用，还具有调节免疫力、抗感染、抗肿瘤等作用。鉴于丹参酮II_A所具有的这些药理作用，认为其符合作为化疗增敏剂的条件，因此本实验选用丹参酮II_A与阿霉素联合使用，检测其对乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响。实验结果显示，丹参酮II_A能明显增强阿霉素对人乳腺癌细胞的增殖抑制、迁移抑制和诱导其凋亡作用，说明丹参酮II_A能增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性。

APC是β-catenin的负向调控因子，其可作为载体将糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）和β-catenin联系起来，促进GSK-3β磷酸化β-catenin，导致β-catenin降解。而高水平的β-catenin可通过GSK-3β使APC蛋白磷酸化，从而促进其对β-catenin的降解效率，使胞质内β-catenin蛋白水平保持在一种平衡状态。研究发现，当APC发生突变或者缺失时，APC虽能与β-catenin结合，但却不能降解β-catenin，使得β-catenin在细胞核内过度聚集，导致细胞发生异常增殖，从而引起肿瘤的发生^[16-19]。还有研究发现，APC发生突变或者缺失时所引起的APC/β-catenin信号通路的异常活化能够介导肿瘤细胞耐药性的发生^[20]。此外，APC/β-catenin通路通过对其下游靶基因如E-cadherin、MMP-2、MMP-9等的调控，调控细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附作用^[21-25]。为探讨APC/β-catenin信号途径是否参与乳腺癌细胞阿霉素耐药发生，首先检测了MCF-7和MCF-7/dox细胞中APC、β-catenin的表达情况，结果显示，与阿霉素敏感的MCF-7细胞相比，MCF-7/dox细胞中APC的表达明显减少，β-catenin表达明显增多，说明APC/β-catenin信号途径参与了乳腺癌细胞阿霉素耐药的发生。为进一步探讨丹参酮II_A增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗敏感性是否与APC/β-catenin信号通路有关，用阿霉素、阿霉素联合丹参酮II_A分别干预乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox细胞，并检测APC、β-catenin、E-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的表达情况。结果显示，与单用阿霉素相比较，

综上所述，推测丹参酮II_A能够通过调控APC/ β-catenin信号通路增强乳腺癌细胞对阿霉素的化疗敏感性。因此，丹参酮II_A可以作为一种潜在化疗增敏剂与阿霉素联合应用治疗乳腺癌。

参考文献（略） 

来  源：吴春霞，樊晨星，王秀艳，袁  松，李  昆. 丹参酮IIA对乳腺癌细胞阿霉素化疗敏感性的影响及相关机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1657-1663.