RT-PCR分子诊断设计——酶选择的考量点

RNA 和DNA 目标片段的成功扩增关键在于合适的聚合酶选择。

RT-PCR与标准PCR技术相比，增加了一步不确定性非常强的步骤——对于RNA模板的逆转录过程。在病毒检测和肿瘤相关检测中，需要从非常小的样本量中扩增特定RNA。与常规RT实验相比，用于临床检测的RT-PCR，必须考虑到临床样本中的酶反应抑制组分，以及需要更高的RT温度使得扩增特异性引物正确结合到特定RNA区域。如果待扩增区域是低丰度的或是困难的二级结构，更加需要慎选能从困难模板中产生最佳cDNA合成效果的RT酶。事实上，具有更高热稳定性的RT酶，是具有困难二级结构的转录本的首选，因此传统的双酶RT-PCR 体系中，常常选择AMV作为RT酶。 

在此基础上，罗氏为您考虑得更多——5min完成RT反应的热启动RT酶！

罗氏CustomBiotech 提供了一种新型实时PCR 反应扩增酶，可同时用于DNA 和RNA 两种靶标扩增的单一酶—— HawkZ05 Fast 聚合酶。HawkZ05 Fast 能在单管中运行一步法RT-PCR，操作流程大大简化。

HawkZ05 Fast 是一种热启动酶，使用寡核苷酸适配体修饰。适配体作为温度依赖性的分子开关，将反应液温度降至+55℃以下，适配体的三级结构引起RT活性和DNA链碱基延伸活性关闭，而在高于+60℃的温度，聚合酶的活性获得完全激活。 

HawkZ05 fast聚合酶的扩增稳健性——在20μl反应体系中，加入不同比例的RNA (HCV-Vic)和DNA (HPV-FAM)模板，使用HawkZ05 fast聚合酶进行检测。顶部图中，固定拷贝数的RNA目标片段和高/中/低浓度的DNA目标片段混合在一起进行检测。对应的，在底部图中，固定拷贝数的DNA目标片段和高/中/低浓度的RNA目标片段混合在一起进行检测。在所有的组合反应中，这两个靶点的扩增结果都获得了很好的一致性。

HawkZ05 Fast聚合酶的性能优势

■ 使分子体外诊断试剂产品的PCR 操作更便捷和灵活

热启动激活的HawkZ05 Fast 聚合酶可同时用于RNA 和DNA靶标检测，如HCV 和HPV。

■ 针对棘手靶标进行试剂盒开发

在60-65℃条件下进行高温逆转录，依然具有极高的RNA 持续合成能力，对低拷贝和复杂二级结构的RNA靶标实现可靠扩增。

■ 快速获得检测结果

44 分钟内即可运行完成RT-PCR 反应，大大缩短检测周转时间（TAT），同时不损失检测灵敏度和线性范围。

■ 轻松应对粗提样品

Hawk Z05 Fast 聚合酶对PCR 抑制剂如肝素、SDS 等显示出高耐受性，对棘手的临床样品类型如粪便或鼻腔拭子等具有稳定的检出性能。

■ 适用于各种PCR 检测应用

可选择无甘油酶形式，用于冻干类产品设计，或用于改善酶溶液加样准确度。

■ 杰出的检测一致性

罗氏的标准化生产流程，及基于多指标严格的QC（质量控制）放行检验，提供了Hawk Z05 Fast 高度的批次间一致性，为体外诊断（IVD）试剂盒生产商和终端使用奠定了高质量的原料基础。

编辑：李佳宸