甘草中新NADPH细胞色素P450还原酶基因的克隆与相关生物信息学分析

摘 要：目的  从甘草Glycyrrhiza uralensis中克隆1个新的NADPH细胞色素P450还原酶基因（GuCPR，登录号：MH401048）并进行生物信息学分析。方法 提取甘草根部总RNA后逆转录为cDNA，通过转录组数据库筛选得到GuCPR基因全长，利用NCBI ORF finder得到其开放阅读框并翻译得氨基酸序列，设计引物进行PCR扩增，构建克隆重组质粒。利用生物信息分析预测蛋白性质、结构等及模拟蛋白三级结构，并构建同源系统进化树。结果  克隆得到GuCPR基因cDNA全长2 118 bp，编码705个氨基酸残基，相对分子质量78 450，等电点（pI）5.19。GuCPR蛋白为非分泌蛋白，不具有信号识别功能。跨膜预测结果显示蛋白的第44～64位氨基酸为跨膜区，同时，亚细胞定位预测结果显示蛋白位于内质网上。结论  克隆得到一个新的GuCPR，并进行了生物信息学分析，为进一步研究提供了理论基础。

甘草是豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G. inflataBat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒等功效，被广泛应用于临床配方，素有“国老”之称。甘草酸是甘草中的主要活性成分，具有广泛的药理活性^[1]。

细胞色素P450酶（CYP450）系是一个非常重要的氧化酶

本研究整合转录组学和生物信息学，通过PCR进行cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNAends，RACE）技术和克隆重组质粒构建技术，成功地从甘草根中克隆了一条尚未报道的甘草细胞色素P450还原酶基因（CytochromeP450 reductase，GuCPR）（登录号：MH401048），并结合相关的生物信息学分析，对GuCPR蛋白进行了预测和理化性质分析，为下一步的原核表达与功能验证提供参考，亦为甘草植物的分子育种、定向培育及活性成分的合成生物学研究奠定基础。

1  材料与试剂

1.1  材料

甘草种子由本课题组保存，经北京中医药大学中药鉴定系主任刘春生鉴定为豆根植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 种子。

1.2  试剂

HS DNA Polymerase购于TaKaRa公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；pEASY-BluntZero Cloning Kit、Trans1-T1 E.coli感受态细胞、EasyPurePlasmid MiniPrep Kit购于北京全式金生物技术有限公司；EASYspin通用植物RNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、DNA Marker（BM-2000、BM-5000）购于北京博迈德基因技术有限公司；LB培养基所需试剂（Tryptone、Yeast Extract、NaCl、琼脂粉）、浓硫酸购于北京拜尔迪生物技术有限公司；引物合成及测序均由生工生物工程公司完成。

2  方法

2.1  GuCPR基因的克隆

取少量甘草种子，浓硫酸浸泡2 h后用清水反复冲洗数十次，清水浸泡过夜后，取出种子轻轻摆放于基质土壤上，上层轻轻覆土，2～3 d浇水1次，3周后取小苗根部提取总RNA，并逆转录成cDNA。以cDNA为模板，使用HS DNA Polymerase进行PCR扩增。本课题组前期对甘草进行的转录组深度测序数据，获得多条细胞色素P450还原酶家族基因，通过数据分析筛选得到的基因编码区全长序列，运用斯坦福大学在线引物设计系统（https://www.yeastgenome.org/primer3）设计特异性引物：g1F 5’-ATGCAGGATTCAAACTCCATGA- AG-3’；g1R 5’-TCACCATACATCACGCAAATACC- TGCC-3’。扩增程序如下：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；55 ℃退火5 s；72 ℃延伸2 min；35个循环；72 ℃延伸8 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，切下目的片段进行回收纯化。PCR产物经回收纯化后，连接至pEASY-BluntZero Cloning Kit构建GuCPR-pEASY克隆重组质粒，并转化Trans1-T1 E. coli感受态细胞（北京全式金有限公司）。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌株进行测序。

2.2  GuCPR基因的生物信息学分析

采用NCBI网站ORF finder页面找到转录组中基因序列的开放阅读框（ORF）并翻译为氨基酸序列；双向测序结果采用Conting Express软件进行拼接，得到GuCPR基因全长序列；使用Protparam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）预测基因编码蛋白的理化性质；使用TMHMM（http://www.工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）对蛋白进行跨膜预测和跨膜区位置计算及分值；使用ProtScale工具（http://ca.expasy.org/ tools/protscale.html）进行蛋白亲疏水性分析。使用SignalP 4.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行蛋白信号肽预测。使用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）数据linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）进行蛋白亚细胞定位预测。使用SWISS-MODEL（http:// swissmodel.expasy.org/repository/）进行蛋白质三级模拟。采用MEGA 6.0软件进行蛋白序列比对分析。

3  结果与分析

3.1  GuCPR基因的克隆

RNA提取结果如图1所示，18 S和28 S 2条带清晰明亮，说明提取的RNA质量较好，完整性较高。逆转录成cDNA后，利用特异性引物进行PCR扩增，结果如图1所示，使用Conting Express拼接双向测序结果，得到2 118 bp的基因全长mRNA序列，编码705个氨基酸残基。将获得的ORF核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示，氨基酸序列与豆科植物鹰嘴豆Cicer arietinum L. 的细胞色素P450还原酶相似性最高，达到90%。

3.2  GuCPR蛋白理化性质的预测

采用protparam在线分析工具（http://www. expasy.org/tools/protparam.html）对GuCPR蛋白的理化性质进行预测，蛋白的相对分子质量78 450，编码705个氨基酸，等电点（pI）为5.19，非极性氨基酸残基（Asp＋Glu）102个，极性氨基酸残基（Arg＋Lys）76个，脂溶系数（Aliphaticindex，AI）为82.87，平均疏水性（grand average of hydropathy，GRAVY）为−0.295（图2），不稳定系数（II）为45.05，是一个不稳定的亲水性蛋白。

3.3  GuCPR蛋白信号肽预测

在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，负责把蛋白质引导到细胞中含不同膜结构的亚细胞器内，即为信号肽序列。本研究采用在线分析工具SignalP 4.1 server预测GuCPR的N端信号肽，默认参数下，结果显示GuCPR蛋白的D值为0.132（图3），小于设定阈值0.500。因此，预测GuCPR可能不含有信号肽，并非为分泌蛋白且不具有信号识别功能。

3.4  GuCPR 蛋白结构域分析

使用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/

wrpsb.cgi）数据库分析GuCPR蛋白的结构域。结果显示GuCPR蛋白在287～691氨基酸序列存在NADPH-cytochromeP450 reductase保守结构域（图4），属于细胞色素P450还原酶超家族。

3.5  GuCPR蛋白跨膜区预测

采用TMHMM Server v.2.0进行GuCPR的跨膜区预测，结果表明GuCPR有一段跨膜螺旋区，即蛋白的第44～64 位氨基酸。蛋白第1～43位氨基酸在膜内侧，第65～705位氨基酸在膜外侧（图5）。

3.6  GuCPR蛋白亚细胞定位预测

采用ProtCompv. 9.0进行GuCPR的亚细胞定位预测，结果表明GuCPR应定位于内质网上，综合打分结果最高，为9.19（图6）。

3.7  GuCPR蛋白三级结构预测

SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/repository/）是一个蛋白质3D结构数据库，库中收录的蛋白质结构都是使用SWISS-MODEL同源建模方法（homology-modelling）得来的。利用SWISS-MODEL在线软件构建GuCPR蛋白的三维结构，使用2vg8.1.A作为模板序列，结果见图7。

3.8  GuCPR系统进化分析

通过NCBI的blast比对GuCPR蛋白序列，按照相似度从高到低排序，从Genbank中下载现有报道的CPR蛋白质序列，采用Clustal W进行多重序列比对分析，然后采用MEGA 6.0的Neighbor-Joining（NJ）算法构建系统发育树（Bootstrap 1 000次分析重复，图8）。结果显示GuCPR与鹰嘴豆Cicer arietinum L.（CaCPR，XP_004507858.1）、豌豆Pisum sativum L.（PsCPR，AAC09468.2）、地三叶Trifolium subterraneum L.（TsCPR，GAU35209.1）、蒺藜Tribulus terrestris L.（MtCPR，XP_003610109.1）可聚为一支，显示较近亲缘关系。

4  讨论

甘草是在中医药中使用最频繁的药材，其主要成分有甘草酸、甘草次酸等三萜类化合物20余种，甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等黄酮类化合物300余种以及各种多糖类化合物，具有抗炎、抗病毒等活性^[14-15]，目前甘草酸完全依赖于从甘草原植物中提取，过度采挖造成甘草资源严重匮乏，而甘草酸的合成生物学研究能大大降低甘草资源的消耗，为甘草酸产业的发展提供充足的原料，是甘草生态资源可持续利用的重要保障。本研究成功克隆了甘草酸生物合成途径中CPR基因，并结合相关的生物信息学分析，预测了GuCPR蛋白的理化性质，结果显示GuCPR基因cDNA全长2 118 bp，编码705个氨基酸残基，相对分子质量78450，pI为5.19。GuCPR蛋白为非分泌蛋白，不具有信号识别功能。跨膜预测结果显示蛋白的第44～64位氨基酸为跨膜区，同时，亚细胞定位预测结果显示蛋白位于内质网上，与一般报道的CPR 蛋白的定位结果一致^[16]。

研究过程中，使用浓硫酸对甘草种子进行预处理，可增加种皮和胚乳的透气性，以促进萌发，缩短种子的催芽时间。本研究对PCR条件做了优化考察，结果显示退火温度与退火时间对扩增结果有显著影响，尝试分别使用5 S与30 S，55、58、62、65 ℃梯度退火，结果显示退火温度55 ℃，退火时间5 s条件下扩增效果最好，特异性最高。本研究使用零背景克隆载体代替传统pMD19-T克隆载体，有效地缩短了实验时间并提高了阳性克隆菌斑数目，提高了实验效率。GuCPR为甘草酸生物合成途径中的关键基因，本研究为进一步表征GuCPR的功能，实现甘草酸多通路生物合成奠定前期基础。

综上所述，本研究从甘草中克隆出GuCPR新基因（登录号MH401048），并结合相关的生物信息学分析方法对GuCPR蛋白进行预测和性质分析，为进一步研究该酶的活性与功能提供理论基础及参考。同时，GuCPR在甘草酸的生物合成途径中发挥重要作用，也为解析甘草酸的生物合成途径奠定基础。

参考文献（略） 

来  源：孙宇峰，厉  妲，黄  颖，杨晓涵，刘春生. 甘草中新NADPH细胞色素P450还原酶基因的克隆与相关生物信息学分析 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1676-1681.