Nature | 探寻NLRP3炎症小体激活之谜

炎症（inflammation）是机体对病原微生物感染和组织损伤一种快速而协调的反应。这些刺激导致免疫细胞向感染和损伤部位迁移。对于许多人来说，炎症被认为是一种不良的机体反应，因为它可以导致严重的后果，如免疫功能障碍，组织损伤，败血症，器官衰竭，甚至死亡。然而，炎症是一个关键的先天免疫过程，它试图控制感染，激活适应性免疫，修复受损组织，并恢复到保持机体的稳态。

炎症小体（inflammasome）是炎症反应中重要的组成部分，由多个蛋白组合而成的复合物,以caspase-1依耐性方式激活促炎细胞因子,包括interleukin-1β(IL-1β),以及诱导炎性细胞死亡。NLRP3炎性小体的不同寻常之处在于，它可以由许多不同的刺激触发，比如nigericin(一种链霉菌的抗生素)或受损细胞释放的ATP。不受控制的NLRP3刺激可导致感染、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢紊乱和许多其他人类疾病。考虑到这些刺激的化学性质和结构的多样性，以及目前缺乏NLRP3直接与任何这些分子相互作用的证据，NLRP3被激活的机制仍然是一个未知之谜。2018年底，美国德克萨斯大学西南医学中心的陈志坚课题组在Nature上在线发表了题为“PtdIns4P on dispersed trans-Golgi network mediates NLRP3 inflammasome activation”的重量级文章，剥开了 NLRP3炎症小体是如何识别大量多样性的激动剂，从而使机体对外界病原体入侵和组织创伤等做出反应的。该文发现了一种不同NLRP3刺激下游共同的细胞信号机制:高尔基体反面网络结构（TGN，trans-Golgi network）分解成各种分散的结构，即形成分散的高尔基体反面网络结构（dTNG,dispersed TGN）。然后NLRP3上的一个多碱性区域与dTGN上带负电荷的PtdIns4P相互作用，将NLRP3招募到dTGN上。dTGN上的NLRP3形成多个点状结构，诱导适配体蛋白（ASC）聚合，从而激活下游信号级联，下面我们就来一起深入了解下这篇文章精彩之处。

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 一种巧妙体外检测NLRP3活性的方法

工欲善其事必先利其器，一个巧妙的实验设计能够简单明了的证明复杂的分子行为过程。本文中研究者建立了一种专门检测NLRP3的活化生化检测方法，一种上游稳定表达NLRP3 (293 NLRP3)或下游特异表达ASC和caspase-1 (293 ASC-casp1)的HEK-293T细胞株。将受刺激处理后的293 NLRP3 (activator )细胞中提取的提取物与下游293 ASC-caspase-1 ( receptor )细胞混合，共同孵育后，检测NLRP3依耐性的caspase-1的裂解。通过体外实验，我们确定了NLRP3活性所在的亚细胞部分。HEK-293T细胞的提取物采用差速离心法分离将NLRP3-GFP细分为P5(重膜)， P100(轻膜)和S100(胞质)三种组分，用NLRP3活性测定法测定其含量。虽然NLRP3蛋白主要存在于S100(胞质)中，然而NLRP3活性仅在P100(轻膜)和P5(重膜)中被检测到(图1)，表明只有一小部分NLRP3在受到刺激后变得活跃。这说明原本主要存在细胞质基质内的NLRP3在激动剂（nigericin，Nig）处理后被招募到囊泡状结构上形成聚合物。

             图1. NLRP 3刺激后形成多点分布

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NLRP3在dTGN上聚集形成聚合物

免疫荧光结果表明，在正常条件下，NLRP3-GFP在胞质中散在分布，但经刺激物处理后形成多个小斑点，这些斑点与ASC存在时形成的单个大斑点不同，这表明NLRP3首先聚集成多个小斑点，然后与ASC合并成一个大斑点。NLRP3的富集表明，这些斑点在粗细胞提取物中比NLRP3具有更高的比活性，表明这些斑点是NLRP3的活性形式，并且NLRP3小点形成于囊泡状结构亚细胞器的外部。为了了解这些小泡的起源，研究者检测了稳定表达NLRP3-GFP的HeLa细胞中的各种亚细胞细胞器。在刺激的条件下，TGN的反式面从单个核周簇分裂成小泡，NLRP3在小泡上形成斑点。

           图2.NLRP3在dTGN上聚集

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NLRP3通过其多碱性区域被招募到dTGN

dTGN的形成早于NLRP3斑点形成，表明dTGN的存在可能是NLRP3招募、聚集和激活的先决条件。这与研究者观察到的NLRP3疾病突变体能够绕过TGN招募是一致的，因为它们能够在不受刺激的情况下聚集在一起。为了研究NLRP3是如何被招募到dTGN的，研究者检测了几个NLRP3的N端截短突变体，发现连续缺失了四个赖氨酸残基（KKKK motif）会突然终止NLRP3聚合。这个基序是一个位于pyrin结构域和NACHT结构域之间的高度保守区域，在所有已知的NLRP3中至少含有三个带正电荷的残基，这些结果表明，包括KKKK基序在内的保守的多碱性区域在刺激后将NLRP3招募到dTGN中起着关键作用，这对于随后的激活至关重要。

     图3.NLRP3通过其碱性区域被招募到dTGN中

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NLRP3通过与PtdIns4P结合而被招募到dTGN

根据前人的报道，几种已知的Rab GTPases通过多碱性区与细胞膜上带负电荷的磷脂PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(4,5)P2结合，为了检测NLRP3中的多碱性区域是否通过类似的机制介导其募集，研究者纯化了NLRP3多碱性区域的片段，并通过脂质印迹法检测其与磷脂的结合，该片段与几个带负电荷的磷脂结合，NLRP3多碱性区域突变体并不能发生结合。接下来，为了研究了在活细胞中，哪种磷脂对全长NLRP3向dTGN的募集起重要作用。研究者利用了磷脂酶的诱导募集体系，在该体系中加入雷帕霉素促进FKBP12和FRB的异二聚，从而将磷酸酶募集到TGN中，使其水解目标磷脂。从而确定NLRP3通过与PtdIns4P结合而被招募到dTGN上的。

  图4.NLRP3通过与PtdIns4P结合而被招募到dTGN

总结与展望

本文综合利用生化、成像和遗传学方法等方法，巧妙的运用细胞株重组系统实验揭示了NLRP3激活的分子机制，进一步在原代性巨噬细胞中验证，揭示了不同来源、以及化学性质和结构特质上千差万别的NLRP3激动剂，触发的一个共同的细胞信号:TGN分解为dTGN，其中NLRP3通过其多碱性区域与dTGN上的PtdIns4P之间的离子键被募集到dTGN上。打破我们对于高尔基体功能传统的认识，即蛋白质进行加工、包装，运输的功能。揭示了高尔基体在炎症信号通路中也发挥重要的功能，然而对于组织创伤和病原微生物感染中如何控制过度的炎症反应，以及对于自身免疫疾病、阿尔茨海默病、癌症等多种疾病的治疗和预防依然还任重道远。

参考资料；

        1.Chen, J. and Z.J.Chen, PtdIns4P on dispersed trans-Golginetwork mediates NLRP3 inflammasome activation. Nature, 2018. 564(7734): p. 71-76.