第一代DNA测序原理介绍

第一代DNA测序技术

    第一代测序技术主要基于化学降解法和双脱氧链终止法的原理，当今仍广泛使用的荧光自动DNA测序技术就是基于双脱氧链终止法衍生而来。下面简单介绍一下二者的基本原理：

基本原理：

    将待测DNA的5‘端的磷酸基团作放射性标记（目的是为了后续读序的DNA都是带放射性标记的，保证5‘端相同），然后利用特定的化学修饰剂对特定的碱基进行修饰，并在降解反应中从众多被修饰碱基处发生随机断裂，所以其降解产物中带放射性标记的单链DNA的3‘末端的碱基为该特定碱基。

    四种化学修饰剂可对应四种情况，最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，通过放射自显影显示分离结果，按照从下往上的顺序进行读序，如图1（G+A和T+C指化学修饰剂对二者都能修饰），读序结果为5’ TAGTATAGCTG 3’。

图一：化学降解法电泳后读序示意图

特点：

1.测序长度大约为250个碱基，准确度较高；

2.可直接测未克隆的DNA片段，不需进行酶催化反应；

3.特别适合测定含有如5-甲基腺嘌呤、G+C含量较高等特殊DNA片段以及短链寡核苷酸片段的序列。

基本原理：

示意图如图二，双脱氧链终止法利用了双脱氧核苷酸能参与DNA复制却因缺乏3‘羟基而终止DAN合成的特性，往DNA合成反应体系中少量加入一种双脱氧核苷酸，该双脱氧核苷酸就会随机掺入新合成DNA链中，使反应体系中产生长短不一的DNA链，但这些DNA的3’端的碱基即为该双脱氧核苷酸所含的碱基，最后进行四种含对应双脱氧核苷酸的DNA复制合成体系，将反应后DNA利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从下往上进行读序。

图二：双脱氧链终止法示意图

序列分析的工作模式：

1. 手动测序：该工作模式强度大，要求操作人员有较娴熟的操作技能，现如今较少应用。

2. PCR测序：将PCR技术应用于测序，减少手工操作DNA复制合成反应耗费的时间，但仍需人工读序等一系列操作。

3. 全自动测序：全自动测序的工作模式是基于Sanger双脱氧终止法的原理，同时采用PCR测序模式，不同的是用了四种不同的罗丹明荧光染料分别标记四种双脱氧核苷酸。由于四种荧光染料可激发出不同颜色的荧光，所以四种链终止反应可在同一个试管内进行并在同一泳道中检测。同时，其产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳进行分离，通过激光激发荧光，最后利用检测系统把荧光信号传输到电脑，电脑就能将荧光信号识别并读序。

常用的DNA测序仪有ABI Prism DNA Sequencer   系列的310、3700和3730XL型号如图三。

图三：ABI Prism DNA Sequencer 3730XL型