骨髓基质细胞中的CHIP通过靶向TRAF家族成员来调节骨量 | 文献精读

作者：陈润峰

来源：科研小助手

摘要：
Hsp70相互作用蛋白（CHIP或STUB1）的羧基末端是E3连接酶，并调节参与不同细胞功能的几种蛋白质的稳定性。我们先前的研究表明，chip缺陷型小鼠通过增强破骨细胞中的TRAF6活性而显示出由于破骨细胞形成增加而导致的骨丢失表型。在这项研究中，我们提供了关于CHIP功能的新证据。我们发现Chip KO小鼠的成骨细胞分化和骨形成也减少了。在来自Chip -/-小鼠的骨髓基质（BMS）细胞中，一组成骨细胞标记基因的表达显著降低。在缺乏chip的BMS细胞中，ALP活性和矿化骨基质形成也减少。我们还发现，除了调节TRAF6外，CHIP还通过促进TRAF2和TRAF5降解来抑制TNF-α诱导的NF-κB信号传导。BMS细胞中Chip的特异性缺失下调了成骨细胞标记基因的表达，这可以通过添加NF-κB抑制剂来逆转。这些结果表明在Chip -/-小鼠中观察到的骨质减少的表型是由于增加的破骨细胞形成和降低的成骨细胞分化的组合。总之，我们的研究结果表明CHIP在骨重建中的重要作用。

INTRODUCTION：

骨重塑是一个动态过程，涉及从骨髓间充质祖细胞衍生的骨形成成骨细胞的活性与源自造血干细胞的骨再吸收破骨细胞的活性之间的平衡。这种平衡的破坏导致许多骨和关节疾病，尤其是代谢性骨病。虽然人们早已认识到骨吸收和骨形成的耦合，但是在骨骼稳态中介导这一基本过程的机制尚不完全清楚。对破骨细胞形成和成骨细胞功能的调节机制的理解对于治疗代谢性骨病的合理药物设计是至关重要的。

破骨细胞来源于造血干细胞，其经历增殖和分化，成为多核骨再吸收破骨细胞。破骨细胞生成的过程受RANKL和TNF-α等几种细胞因子的调节，后者激活NF-κB信号。TNF-α受体相关因子（TRAFs）是细胞内衔接蛋白，在NF-κB信号传导中起关键作用。在TRAF家族成员中，TRAF2，TRAF5和TRAF6已被证明可激活NF-κB信号.TRAF2和TRAF5与TNF-α受体相互作用和介导TNF-α诱导的破骨细胞形成。在TRAF2缺陷细胞中，TNF-α诱导的破骨细胞形成受到严重减弱。在TRAF5缺陷的骨髓基质（BMS）细胞中也发现了类似的结果。因此，TRAF2和TRAF5都是TNF-α诱导的破骨细胞形成所必需的。此外，TRAF6与RANK相互作用以激活NF-κB信号传导，进而调节破骨细胞的形成。多个TRAF家族成员，包括TRAF 2,3,5和6，已被证明在调节NF-κB信号传导中发挥重要作用。在先前的研究中，我们检查了CHIP对TRAF6蛋白稳定性的影响。在本研究中，我们进一步检查了CHIP对TRAF2,3和5的蛋白质稳定性的影响。我们发现除TRAF6外，CHIP还诱导TRAF2和TRAF5的降解，但不诱导TRAF3的降解。

成骨细胞是源自间充质祖细胞的细胞类型，负责骨形成。破骨细胞和成骨细胞是涉及骨小梁骨重建的两种主要细胞类型。先前的几项研究已经证明NF-κB信号传导在调节骨中的破骨细胞和成骨细胞活性中起关键作用。NF-κB信号传导的激活促进破骨细胞形成并抑制成骨细胞功能。

CHIP是一种E3连接酶，据报道它可促进涉及不同信号通路的几种底物的泛素化和降解。体内研究结果表明，chip缺乏导致对压力相关的局部高温敏感性增加，导致小鼠寿命显著缩短。此外，Chip-/-小鼠在心脏和神经组织中出现严重缺陷。此外，Chip-/-小鼠在运动感觉，认知和生殖功能方面表现出缺陷。尽管NF-κB在骨重建过程中的调节机制已经广泛存在。研究表明，CHIP在调控NF-κB信号传导和成骨细胞功能中的作用尚未得到证实。我们之前的研究表明，Chip -/-小鼠由于破骨细胞形成的增加而发展为骨质减少的表型。在本研究中，我们研究了CHIP在调节多个TRAF家族成员的蛋白质稳定性，NF-κB信号传导和成骨细胞功能中的作用。我们的研究结果为CHIP在破骨细胞和成骨细胞功能调节中的作用提供了新的见解。

RESULTS：

Chip -/- 小鼠的骨量减少

为了确定CHIP在骨骼发育中的作用，我们使用出生后3天龄野生型（WT）和Chip KO小鼠进行全骨骼茜素红/阿尔新蓝染色。Chip-/-小鼠骨骼的大小远小于WT同窝小鼠和Chip杂合 KO小鼠（Chip +/-）的大小（图1a）。我们还分析了1个月大的Chip -/-小鼠的外观。Chip -/-小鼠的大小也小于WT和Chip +/- KO小鼠（图1b）。X射线照相分析显示，与WT和Chip +/- KO小鼠相比，在1个月大的Chip -/-小鼠中脊柱的长度更短并且椎骨的骨密度降低（图1c）。为了进一步证实Chip -/-小鼠脊柱的变化，在椎骨切片上进行了番红O /固绿染色。结果显示，与WT同窝小鼠相比，1个月大的Chip -/-小鼠脊柱中的椎骨体积显着减少（图1d）。

这些结果表明，Chip缺陷的小鼠导致骨丢失表型。

Chip - / -小鼠破骨细胞形成和成骨细胞功能的改变
在Chip - / -小鼠中观察到的骨质减少的表型可能是由于骨吸收增加或骨形成减少。为了确定缺陷对骨形成的影响，进行骨组织学和钙黄绿素双标记测定。结果显示Chip-/-小鼠的骨量和骨形成率显着降低（图2a-d）。此外，我们还发现Chip -/-小鼠的成骨细胞数量显著减少（图2e）。为了确定CHIP在骨吸收中的作用，我们使用来自1个月大的WT和Chip - /- 小鼠的胫骨的组织切片进行TRAP染色。数据显示，在Chip - / -小鼠中TRAP阳性破骨细胞数量显着增加（图2f，g）。这些结果表明在Chip - / -小鼠中观察到的骨丢失表型可能是由于骨吸收增加和骨形成减少的组合。为了进一步确定成骨细胞分化的变化，我们从1个月大的WT和Chip - / -小鼠中分离BMS细胞，并通过实时PCR检测Ki67表达并进行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色测定。结果显示，与从WT小鼠分离的BMS细胞相比，chip缺陷型BMS细胞中Ki67表达显著降低并且ALP活性和矿化骨基质形成显着降低（图2h，i）。这些结果进一步证明了Chip -/- 小鼠的成骨细胞功能降低。

ki67在细胞分裂的各个周期都是表达的，然而当M期结束后，ki67就会很快降解（大约半个小时后），所以处于G0期的细胞是不表达ki67的。那么，利用这个特性，我们可以用相应的抗体给细胞染色，从而知道在某一个时间点上，究竟有多少的细胞处在分裂增殖的阶段，有多少细胞处在静止的阶段。

CHIP调节多个TRAF家族成员的蛋白质稳定性

我们之前的研究表明，CHIP促进TRAF6降解并抑制RANKL诱导的NF-κB信号传导.为了进一步确定CHIP调节TRAF6信号传导的机制，我们进行了一系列体外实验，用293T细胞以确定CHIP是否影响TRAF6与IKK的相互作用。我们发现CHIP直接与TRAF6相互作用（图3a）.IL-1β增强CHIP / TRAF6相互作用（图3b）。CHIP的表达显著抑制293T细胞中的TRAF6 / IKK-β相互作用（图3c）。这些结果表明CHIP可通过诱导TRAF6降解来抑制TRAF6 / IKK-β相互作用。

鉴于TRAF2，TRAF3和TRAF5属于相同的TRAF家族并在TNF-α诱导的NF-κB信号传导中起关键作用，我们接下来检查CHIP是否影响TRAF2，TRAF3和TRAF5的稳定性。Western blot分析结果显示，当293 T细胞中CHIP表达增加时，TRAF2的蛋白水平降低。相反，缺乏E3连接酶能力的突变CHIP（H260Q）未能影响TRAF2的稳态蛋白水平（图4a）。我们通过评估用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理细胞后TRAF2蛋白水平的变化，进一步检查了TRAF2蛋白的半衰期。结果显示TRAF2蛋白的半衰期通过WT CHIP大大降低，但不是由突变CHIP（H260Q）降低（图4b）。这些结果表明CHIP是TRAF2蛋白的负调节物。我们还检测了CHIP诱导的TRAF2降解的蛋白酶体依赖性，发现CHIP介导的TRAF2降解可以通过添加蛋白酶体抑制剂MG-132来逆转（图4c），表明CHIP诱导的TRAF2降解是蛋白酶体-依赖。此外，当CHIP表达增加时，TRAF5的蛋白质水平也降低（图4d）.IP结果证明TRAF5在293T细胞中通过CHIP共沉淀（图4e）。为了确定chip诱导的TRAF5降解是否依赖泛素/蛋白酶体，我们用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞。结果表明，结果显示CHIP诱导的TRAF5降解可以通过MG-132的处理逆转（图4f）。相反，CHIP对TRAF3降解没有显著影响（数据未显示）。总之，CHIP调节多个TRAF家族成员的蛋白质稳定性。

CHIP抑制TRAF介导的NF-κB信号传导:

由于CHIP调节TRAF2和TRAF5蛋白水平，TRAF2和TRAF5在TNF-α诱导的NF-κB信号传导中起重要作用，我们随后检测了CHIP是否影响TNF-α诱导的I-κBα磷酸化和p65核转位。结果显示CHIP的过表达显着抑制TNF-α诱导的I-κBα磷酸化（图5a）。值得注意的是，CHIP转染后I-κBα总蛋白水平升高。这可能是因为在表达CHIP的细胞中磷酸化诱导的I-κBα降解减少。接着，我们使用细胞质和核蛋白的部分进行蛋白质印迹分析，并检查p65定位的变化。结果表明，当用TNF-α处理细胞40分钟时，CHIP的过表达阻止了p65核易位（图5b）。这些结果表明CHIP抑制TNF-α诱导的I-κBα磷酸化。为了获得关于CHIP在p65核易位中的作用的其他证据，我们进行了免疫染色测定，发现CHIP的转染抑制了p65核易位（图5c）。

为了进一步确定CHIP在NF-κB信号传导中的作用，我们进行了NF-κB荧光素酶测定。将NF-κB受体构建体用HA-CHIP或空载体转染到从用或不用TNF-α处理的1个月大的WT小鼠中分离的BMS细胞中。结果表明，TNF-α处理后NF-κB报告基因活性显著增加。然而，转染CHIP显着抑制NF-κB活性（图5d）。为了确定CHIP在TRAF2，TRAF5和TRAF6调节的NF-κB活性中的作用，我们将有或没有CHIP的TRAF2，TRAF5或TRAF6表达质粒转染到BMS细胞中。结果显示TRAF2，TRAF5和TRAF6诱导的 CHIP共表达显着抑制NF-κB活性（图5e-g）。总之，这些结果表明CHIP负调节TRAF2，TRAF5和TRAF6诱导的NF-κB活性。

CHIP调节成骨细胞基因表达

为了研究CHIP在成骨细胞分化中的作用，我们首先检测了几种对成骨细胞分化至关重要的蛋白质水平的变化，如β-catenin，Runx2和Smad3。以前的体外研究表明，CHIP调节这些蛋白质在不同细胞类型中的蛋白质稳定性.令人惊讶的是，这些分子的蛋白质水平在chip缺陷型BMS细胞中没有显着变化（数据未显示）。我们接下来通过实时PCR测定检查了一组成骨细胞标记基因的表达。在来自1个月大的Chip - / -小鼠的BMS细胞中，Osterix（Osx）和碱性磷酸酶（Alp）的mRNA水平显着降低（图6a，b）。因此，早期成骨细胞分化标志物如I型胶原（Col1）和骨桥蛋白（OPN）的表达在Chip缺陷型 BMS细胞中也显著降低（图6c，d）。CHIP缺陷型BMS细胞中晚期成骨细胞标志物基因（如骨涎蛋白（BSP）和骨钙素（OC））的表达水平也显著降低（图6e，f）。这些数据表明Chip-/ -小鼠的成骨细胞分化削弱。

在这项研究中，我们还检查了BMS细胞中骨保护素（OPG）和Rankl的mRNA表达。我们发现在缺乏chip的BMS细胞中OPG表达略微降低（图6g）。相反，在chip缺陷型BMS细胞中Rank1表达显著增加（图6h）。这些结果表明，成骨细胞分化的减少有助于在Chip -/-小鼠中观察到的骨丢失表型。

为了进一步确定CHIP在成骨细胞功能中的特定作用，我们生成了Chip flox / flox小鼠。我们从1个月大的Chip flox / flox小鼠中分离出BMS细胞，并用Ad-CMV-Cre病毒感染这些细胞。结果显示，BMS细胞中chip的体外缺失显着降低了chip缺陷型BMS细胞中CHIP蛋白水平（图7a）并抑制了成骨细胞标记基因（包括Osx，Col1a1，OPN，BSP和OC）的表达（图7）。.7b-f）。

CHIP调节的成骨细胞功能是NF-κB依赖性的

为了确定chip缺乏介导的成骨细胞分化抑制是否依赖于NF-κB，我们从1月龄的Chip flox / flox小鼠中分离出BMS细胞，并用Ad-CMV-Cre或Ad-CMV-GFP（对照病毒）感染这些细胞， 用或不用NF-κB抑制剂BP-1-102处理细胞。我们检测了这些细胞中几种成骨细胞标记基因表达的变化，发现用NF-κB抑制剂处理显著逆转了对chip缺陷型BMS细胞中观察到的成骨细胞标记基因表达的抑制作用（图8）。BP-1-102在体外和体内抑制核NF-κB的保留，从而减弱NF-κB的活化。这些结果表明CHIP通过NF-κB依赖性机制调节成骨细胞分化。

讨论

骨重塑是一个高度协调的过程，涉及骨吸收和骨形成。Chip -/- 小鼠骨重建的动态过程受损，表明CHIP在骨重建中起关键作用。我们之前的研究结果表明，在Chip -/- 小鼠中观察到的骨丢失表型是由于破骨细胞形成和骨吸收异常增加所致。在目前的研究中，我们提供了新的证据，即除了增强的破骨细胞形成外，小鼠CHIP的缺陷也导致骨形成减少。

NF-κB及其信号分子在调节破骨细胞形成和成骨细胞功能中发挥关键作用，和TRAF家族成员是NF-κB信号传导的关键介质。我们之前的研究表明，缺乏CHIP的破骨细胞中TRAF6蛋白水平增加，我们已经描述了CHIP对TRAF6蛋白稳定性调节的影响。在本研究中，我们进一步研究了CHIP在TRAF6 /IKKβ相互作用和TRAF2和TRAF5蛋白稳定性和功能中的作用。我们发现1）CHIP干扰TRAF6 /IKKβ相互作用; 2）CHIP诱导TRAF2和TRAF5蛋白降解; 3）CHIP抑制TRAF2和TRAF5诱导的NF-κB信号传导。这些结果表明CHIP通过调节多个TRAF家族成员作为NF-κB信号传导的关键调节剂。

成骨细胞/破骨细胞交互作用以非常精确的方式调节骨形成和骨吸收。例如，破骨细胞骨吸收的关键调节因子是RANKL，其由活化的成骨细胞表达。它对破骨细胞RANK受体的作用受诱导受体OPG的调节，OPG也在成骨细胞中表达。在缺乏chip的BMS细胞中，Rankl表达显著增加（图6j）。这些结果表明，除了通过促进TRAF降解直接调节骨吸收外，CHIP还通过控制成骨细胞/破骨细胞交互作用间接增强破骨细胞形成。

虽然以前的研究表明CHIP在体外调节β-catenin，Runx2和Smad3的蛋白质稳定性，但在本研究中我们没有检测到这些分子的稳态蛋白质水平的显著变化，除了chip缺陷型BMS细胞中β-catenin蛋白水平的轻微降低（数据未显示）。已知NF-κB信号传导的激活抑制成骨细胞功能;然而，细节机制仍未定义。最近的研究表明，细胞类型特异性基因的转录增强子可以作为信号整合中枢与信号依赖性转录因子结合，如NF-κB和谱系决定转录因子，如Runx2，以控制基因表达程序并确定细胞分化命运。这可以解释为什么NF-κB调节成骨细胞功能而不改变Runx2蛋白水平。

众所周知，NF-κB信号在炎症和类风湿性关节炎（RA）中起重要作用。除炎症外，NF-κB信号传导的激活还通过破骨细胞形成的上调和成骨细胞功能的抑制导致骨质流失。在本研究中，我们证明CHIP通过诱导多个TRAF家族成员（包括TRAF 2,5和6）的降解来抑制NF-κB信号传导。在Chip -/- 小鼠中，破骨细胞形成增加并且成骨细胞分化被抑制，已被目前的研究证明。这些发现表明CHIP可能在RA疾病的发展中起重要作用。在RA发展期间可以抑制CHIP的表达或功能，由于增加的破骨细胞形成和降低的成骨细胞功能，导致关节组织中NF-κB信号传导和骨丢失表型的激活。为了进一步确定CHIP在关节组织中的特定作用，我们最近生成了Chip flox/flox小鼠。使用组织特异性敲除方法，我们将进一步剖析CHIP在骨和软骨组织中特定细胞群中的特异性作用，包括间充质干细胞（MSCs），成骨细胞和破骨细胞谱系细胞以及滑膜细胞。

总之，在本研究中，我们证明在Chip-/-小鼠中观察到的骨丢失表型是由于骨吸收增加和骨形成减少的组合。由于破骨细胞形成的异常增加和成骨细胞功能的降低可能导致骨和关节疾病，我们的研究结果表明CHIP可以作为治疗骨丢失相关疾病的药物开发的新靶点。

参考文献：

Wang, T., et al. CHIP regulates bone mass by targeting multiple TRAF family members in bone marrow stromal cells. Bone Res 6, 10 (2018).