新一代数字PCR技术-分子检测的新机遇

喂，请问是滴滴吗....

亲，我不是滴滴，我是ddPCR。

对于广大的检验人，PCR是分子诊断最基本的技术之一，这些仪器大家肯定不陌生，天天跑PCR，PCR天天见。

但是，你见过它吗？

是不是感觉熟悉又陌生？

亲，PCR技术升级啦

微式数字PCR（Droplet Digital PCR, 简称ddPCR）属于第三代PCR技术，是基于微纳米技术，将核酸检测划分为单分子水平的一种方法，在纳米级别上实现对核酸分子进行绝对定量的检测。

滴滴都是PCR

ddPCR的原理（如图示）是将目标分子与油混合后通过微滴化处理，形成千上万个纳米级的微滴。

目标分子在微滴中进行PCR扩增反应。PCR扩增反应结束后，软件对每个微滴的荧光信号进行识别检测（如图示）。其中有荧光信号的读作1，没有荧光信号的读作0，根据泊松分布的原理，计算出目标分子的初始浓度或者初始拷贝数。

对比传统PCR技术，ddPCR技术的优点是显而易见的：

1. 真正的绝对定量：

   可以直接检测核酸分子的绝对数目，其灵敏度可低至单拷贝。与第二代荧光定量PCR相比，它既不依赖扩增效率，也无需做标准曲线。

2. 真正的低起始量：

   ddPCR需要的样本量少，它克服了第二代荧光定量PCR系统的缺点，能精确的对低丰度低拷贝样本进行定量检测，特别适合于痕量样本的精准检测。

Easy3steps

ddPCR实验步骤

1	PCR反应液制备
2	微滴生成
3	微滴内PCR反应

ddPCR未来'钱'景广阔

在“十三五”医疗器械科技创新专项规划中，无创检测和液体活检已经被提名为全国规划中的第一大任务，政府对基因检测行业开放了持续性的利好政策。由于无创检测和液体活检技术已在肿瘤早期筛查，肿瘤诊断及靶向药物使用评估，产前诊断等疾病领域广泛被应用，产业的发展和应用需求激增，使得ddPCR应用市场前景广阔。

对于广大的群众而言，我们更关心的是在实际应用中，ddPCR还可以为我们提供什么样的服务呢？我们来说几个比较具有代表性的应用。

临床应用

临床早期检测

由于ddPCR的灵敏度非常高，只需要极少的模版量就可以完成定量分析，临床医师采用ddPCR技术可以对各种肿瘤进行早期筛查。 受检者只需要提供4ml外周血，就能实现肿瘤的早期无创筛查。

临床研究

1. 基因表达微小差异的研究

ddPCR的灵敏度可低至0.01%，可专门针对表达差异微小的靶基因，例如mRNA、microRNA, lncRNAs和外泌体核酸。对于基因数低拷贝，不平衡表达的情况，ddPCR可以提供比荧光定量PCR更精确的基因差异表达分析。

2.单细胞测序的研究

对于单细胞样本中的低丰度，单拷贝转录本，ddPCR采取的独立油滴PCR方式可以有效的将其与高丰度的转录本区分开来，确保低丰度基因的有效扩增。基于此特性,ddPCR也能为单细胞测序的后续建库提供助力。

3. CRISPR和NGS技术的后续验证

CRISPR-Cas9的编辑实验是否成功，需要依靠高灵敏度的检测方法来判断。 相比于传统的PCR技术只能对结果进行相对定量，能够精准定量的ddPCR技术更胜一筹。对于NGS技术发现的CNV位点，ddPCR提供了一种快速,准确，高灵敏度的验证方法。

4.甲基化鉴定

传统的甲基化鉴定采用的是亚硫酸氢盐预处理，后续经抗体检测或者测序以及定量PCR等方法来测定甲基化程度，但均不能获得甲基化程度的精确定量。而ddPCR通过对微液滴中样本分子的拷贝数进行定量，实现甲基化程度的直接定量检测。

工欲善其事必先利其器

随着基因检测产业的不断发展，竞争也愈发激烈，而具有高灵敏度和特异性的ddPCR已经成为这场竞备赛中的一大热点。这就不得不提到其中的翘楚Bio-Rad公司。2019年伊始，该公司旗下的QXDx™ AutoDG™ ddPCR™系统和相关试剂盒已经获得美国FDA批准，成为全球首个获得FDA认证的数字PCR产品。

到目前为止，已有3,400多篇文献引用了ddPCR技术。

Bio-rad 的技术最早来源于QuantaLife公司，该公司利用油包水滴的原理开发出了微滴式数字PCR技术。2011年，Bio-Rad 公司正式收购该技术并开始向市场推广和普及数字PCR技术，并于2013年整合并升级了旗下的所有微滴式数字PCR仪器，将其命名为QX200。 这是目前市场上最成熟的ddPCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。

我们的服务

上海伯豪生物技术有限公司引进Bio-rad最先进的ddPCR仪器QX200，迄今为止，已经为多家临床机构提供各类型样本的分析服务。 对于珍贵稀有的临床样本，包括FFPE,血清，血浆（包括cfDNA），及其他类型降解样本，上海伯豪的ddPCR平台为客户提供比第二代荧光定量PCR技术更高准确度的定量分析。同时，我们也为临床客户提供各类肿瘤靶向药物的基因检测服务，采用ddPCR技术为NGS测序定制快速的高通量验证，指导临床的精准用药。

我们的优势

1.   伯豪生物率先引进Bio-rad最先进的ddPCR仪器QX200，建立起成熟的数字PCR平台。

2.  客户所需提供的样本起始量低，例如珍贵的FFPE样本，其上样量可以低至5ng。

3.  针对临床肿瘤个性化用药提供21个基因检测的位点。

4.  我们拥有独立的ddPCR研发与实验团队，依靠伯豪15年在分子检测领域的丰富经验和规范化的实验平台，为客户提供完善的实验体系和稳定可靠的实验结果。

5.  伯豪生物背靠强大的数据分析团队，善于针对文章进行多角度的数据挖掘，帮助客户实现数据分析流程化与个性化相结合。

6.  公司拥有配套的第三方临床检测实验室和完善的GMP车间，解决国民的疾病与健康问题；针对临床专家科研的不同需求，实现个性化的定制服务。