丹酚酸B抑制碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡的作用及机制

白激酶B（p-Akt）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）及Klotho蛋白表达量。结果 与对照组比较，模型组细胞活力显著降低（P＜0.01），部分细胞核出现染色质浓缩及核分裂等凋亡特征，ROS水平及Bax、、p-ERK1/2蛋白表达水平显著增加（P＜0.05、0.01），而Bcl-2、p-Akt及Klotho蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；丹酚酸B 50、100、200 μmol/L可以部分逆转碘普罗胺的上述效应。但低浓度的丹酚酸B（1、10 μmol/L）对碘普罗胺诱导的HK-2细胞无明显保护作用。结论 丹酚酸B可以抑制碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡，其机制可能与抗氧化应激，激活Akt信号通路、抑制ERK信号通路及上调Klotho蛋白表达有关。

造影剂肾病（contrast-induced nephropathy，CIN）是冠状动脉介入手术的重要并发症。在行冠状动脉造影时使用等渗造影剂碘克沙醇或低渗造影剂碘普罗胺均可能导致CIN的发生，尤其是对于已有肾功能障碍的患者，CIN的发生率更高。CIN可导致慢性肾功能衰竭、心功能不全等，增加患者的死亡率，因此CIN的危害不容小觑^[1]。目前临床上针对CIN的治疗措施还十分有限，仅依靠水化治疗及对症治疗。因此，寻求更为有效的防治CIN的措施具有十分重要的意义。

丹酚酸B是丹参的主要水溶性有效成分，由3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，分子式为但其对碘普罗胺诱导的肾小管上皮细胞损伤是否有保护作用尚不清楚。因此，本研究以人肾近端小管上皮HK-2细胞为研究对象，探讨丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞损伤的保护作用及机制，为开发防治CIN的药物提供实验依据。

1  材料

1.1  细胞

HK-2细胞由中山医学院高血压研究所王蔚东教授提供。

1.2  药品与试剂

DMEM/F12培养基及胎牛血清购于Gibco公司；培养皿、培养板购于美国Corning公司；低渗造影剂碘普罗胺（碘质量浓度为370 mg/mL）由拜耳医药保健有限公司提供；丹酚酸B（批号180609，质量分数≥98%）由上海融禾医药公司提供；荧光探针DCFH-DA及DAPI染色剂购于美国Sigma- Aldrich公司；兔抗Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗Klotho多克隆抗体购自美国Absin公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国KPL公司。RIPA裂解液（强）由上海碧云天生物技术有限公司提供。

1.3  仪器

Multiskan Mk3全波段酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Chemstudio双色近红外多功能成像仪（德国Analytik Jena有限公司）；Mini- PROTEAN Tetra电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；IX71荧光显微镜（日本Olympus公司）；CyFlow Cube流式细胞仪（德国Partec公司）。

2  方法

2.1  细胞培养

HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37 ℃恒温培养箱（5% CO₂、饱和湿度）中培养，待细胞长至铺满瓶底约90%时用0.25%的胰酶（含EDTA）消化，2 d传代1次。取处于对数生长期且生长状态良好的细胞进行实验。

2.2  分组及给药

实验共设8组，即对照组、模型组（碘普罗胺111 mg/mL）、不同浓度的丹酚酸B处理组（碘普罗胺111mg/mL＋丹酚酸B 1、10、50、100、200 μmol/L）及丹酚酸B对照组（丹酚酸B 200 μmol/L）。碘普罗胺质量浓度的设置参考前期研究结果^[7]，以碘的质量浓度计。

2.3  细胞活力测定

将HK-2细胞接种于96孔板（3×10³个/孔），培养过夜后随机分为对照组、模型组、不同浓度丹酚酸B处理组及丹酚酸B对照组，另设空白组，每组设置5个复孔，除对照组及丹酚酸B对照组外，各组分别加入碘普罗胺和相应浓度的丹酚酸B。培养24 h后，吸除培养

细胞存活率＝(A_实验－A_空白)/(A_对照－A_空白)

2.4  DAPI染色法观察细胞核形态变化

将HK-2细胞接种于6孔板中（3×10⁴个/孔），培养过夜后弃上清液，分组及处理同“2.2”项下。继续培养24 h后，吸除培养基，用预冷的PBS洗3遍，再用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，去除多余的多聚甲醛。加入终质量浓度为1 μg/L的DAPI溶液避光常温下孵育20 min，PBS洗3次，除去多余的染色液，荧光显微镜观察各组细胞核形态并随机选取10个不同的视野进行拍照。

2.5  细胞活性氧（ROS）水平测定

将HK-2细胞密度调整为3×10⁴个/mL并接种于6孔板，每孔加入1 mL细胞悬液。培养过夜待细胞充分贴壁后按照“2.2”项下分组及给药。24 h

2.6  Western blotting法检测HK-2细胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、p-Akt、p-ERK1/2及Klotho蛋白表达水平

将HK-2细胞密度调整为3×10⁴个/mL并接种于60 mm培养皿中，每皿加入3 mL细胞悬液。按“2.2”项下分组进行处理后，用含有PMSF 1 mmol/L的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白（每组蛋白上样量为50 μg）并转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭60 min，分别加入Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、p-Akt、p-ERK及Klotho蛋白抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），TBST洗膜3次，每次10 min。采用化学发光法检测，在暗室用胶片显影或双色近红外多功能成像仪扫描后，用ImageJ软件对各蛋白条带的灰度值进行半定量分析，并记录结果。

2.7  统计学分析

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用LSD-t法。

3  结果

3.1  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞活力的影响

结果表明，对照组细胞存活率为（100.00±（49.40±2.42）%、（53.89±1.94）%、（58.93±5.88）%、（57.77±5.17）%、（58.66±6.42）%，其中丹酚酸B 50、100、200 μmol/L处理组与模型组比较差异显著（P＜0.05），见图1。

3.2  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡形态的影响

由图2可见，对照组及丹酚酸B对照组细胞核染色均匀，呈现低密度蓝色荧光。用碘普罗胺处理24 h后，部分细胞核呈现高密度荧光，并出现核固缩或核分裂等凋亡特征，表明碘普罗胺可诱导细胞凋亡。加入丹酚酸B 50、100、200 μmol/L处理后，具有凋亡特征的细胞核明显减少。

3.3  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞ROS水平的影响

图3。用流式细胞仪进一步检测各组细胞的平均荧光强度后得到的结果与显微镜下观察结果一致。与对照组细胞的平均荧光强度相比，模型组细胞平均荧光强度显著增强（P＜0.01）。与

3.4  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

由图6可见，与对照组比较，碘普罗胺能显著上调Bax及cleaved Caspase-3蛋白表达水平（P＜0.05），同时下调Bcl-2蛋白表达水平（P＜0.01）。0.05、0.01），并上调Bcl-2蛋白表达水平（P＜0.01）。

3.5  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞p-Akt及p-ERK1/2蛋白表达的影响

由图7可见，与对照组比较，碘普罗胺能显著下调HK-2细胞p-Akt蛋白表达水平，上调p-ERK1/2蛋白表达水平（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，丹酚酸B 50、100、200 μmol/L能明显上调HK-2细胞p-Akt蛋白表达水平，下调p-ERK1/2蛋白表达水平（P＜0.05、0.01）。

3.6  丹酚酸B对碘普罗胺诱导的HK-2细胞Klotho蛋白表达的影响

由图8可见，与对照组比较，模型组细胞Klotho蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，丹酚酸B 50、100、200 μmol/L能显著上调Klotho蛋白表达水平（P＜0.01）。

4  讨论

肾小管上皮细胞凋亡在CIN的发生中具有重要作用^[8]。本课题组前期研究中，证实碘普罗胺以剂量依赖方式抑制体外培养的HK-2细胞增殖并诱导细胞凋亡^[9]。根据前期的工作基础，本研究采用111 mg/mL的碘普罗胺作用HK-2细胞24 h制备CIN体外损伤模型。

丹酚酸B是从常用中药丹参中提取出来的水溶性成分。研究表明，丹酚酸B具有明显的抗凋亡作用^[10]。在急性心梗大鼠模型中，丹酚酸B可以通过促进自噬及抑制凋亡减轻大鼠心肌损伤^[11]。在阿霉素诱导的心脏毒性动物模型中，丹酚酸B可以通过抑制内质网应激及激活PI3K/Akt信号通路减轻阿霉素诱导的心脏功能障碍和心肌细胞凋亡^[12]。在碘海醇引起的肾损伤模型中，丹酚酸B可以显著减少肾小管凋亡阳性细胞数^[13]。本实验结果显示，加入高浓度的丹酚酸B（50、100、200 μmol/L）可以有效提高碘普罗胺诱导的HK-2细胞的细胞活力，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，下调促凋亡蛋白Bax及的表达水平，降低细胞凋亡水平。但低浓度的丹酚酸B（1、10 μmol/L）则无明显的抗凋亡作用。

ROS主要是在线粒体氧化磷酸化过程中产生。正常情况下，线粒体产生的ROS可通过抗氧化防御体系清除。若ROS生成过多，引起ROS的产生与清除失衡，会导致细胞发生氧化应激，造成生物大分子物质损伤，引起细胞凋亡^[14]。在本研究中，HK-2细胞经碘普罗胺处理后，ROS水平明显升高，而加入丹酚酸B 10、50、100、200 μmol/L后，ROS水平明显降低，提示丹酚酸B抗凋亡的作用可能与抗氧化应激有关。

PI3K/Akt信号通路及p-ERK-MAPK信号通路均参与细胞凋亡过程^[15]，但近年来研究发现两者在凋亡中的作用相反。在神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶（MPP^＋）诱导的神经细胞凋亡中伴随着Akt信号通路的抑制以及ERK信号通路的激活^[16]。在参脉注射液对H₂O₂诱导的新生大鼠心肌细胞损伤的保护作用研究中发现，ERK和Akt信号通路在心肌细胞凋亡中发挥着相反的作用，用Akt磷酸化抑制剂LY294002预处理可以抑制参脉注射液对心肌细胞的保护作用，而用ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059预处理则可增强参脉注射液的保护效应^[17]。在本研究中，HK-2细胞经碘普罗胺处理后，p-Akt蛋白表达水平明显下调，而p-ERK1/2蛋白表达水平则明显上调，丹酚酸B 50、100、200 μmol/L处理后，可以部分逆转碘普罗胺对ERK和Akt信号通路的作用。提示丹酚酸B抗凋亡的作用可能与其激活Akt信号通路及抑制ERK信号通路有关。

Klotho蛋白是肾功能下降早期敏感的标记物，Klotho缺陷可诱导细胞衰老并使细胞易受氧化应激损伤，引起细胞凋亡^[18]。用Klotho预处理可有效抑制心肌H9c2细胞和新生儿心肌细胞中高葡萄糖诱导的炎症、ROS水平升高、细胞凋亡及线粒体功能障碍^[19]。外源性加入Klotho蛋白可以对抗由H₂O₂此外，用Klotho蛋白与高葡萄糖共处理小鼠足细胞，可

综上所述，丹酚酸B可以有效对抗碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡，其机制可能与其抗氧化、激活Akt信号通路、抑制ERK信号通路及上调Klotho蛋白表达水平有关。

参考文献（略） 

来  源：高昕乐，陈  阳，罗  婷，赵晓朵，庄晓东，吴秀香，凡  栋，陈燕玲，何柳桦，靳俊峰. 丹酚酸B抑制碘普罗胺诱导的HK-2细胞凋亡的作用及机制 [J]. 中草药, 2019, 50(10):2398-2404.