同源重组（HR）是一种普遍保守的DNA双链断裂（DSB）修复途径，它使用存储在姐妹染色单体中的信息来修复破碎的基因组。在真核生物中，HR由MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物启动，其快速定位于人细胞中的DSB。单链DNA ( ssDNA)是通过核降解两条DNA链中的一条而产生的。
复制蛋白A（RPA）快速包被DNA切除过程中产生的ssDNA形成RPA-ssDNA细丝，随后被共济失调毛细血管扩张症-Rad3相关蛋白（ATR）、共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNAPKcs）磷酸化。虽然RPA磷酸化是对DNA损伤的反应，并且经常被用作DSB切除的显示器，但是表达类似于磷酸化的RPA突变体的细胞在DNA重组和修复方面存在缺陷。然而，我们对RPA磷酸化在DNA切除过程中的作用以及测量和终止DNA切除的机制尚未完全了解。
2019年5月29日，德克萨斯大学奥斯汀分校的 Ilya J. Finkelstein 团队在 Molecular Cell 杂志发表题为：RPA Phosphorylation Inhibits DNA Resection 的研究论文。
该研究通过使用单分子荧光成像和细胞实验鉴定了磷酸化的RPA（pRPA）是DNA切除的负向调节因子。布卢姆综合征(BLM)解旋酶与外切酶1 (EXO1)和DNA2核酸酶共同催化核小体包被DNA上的千碱基长度DNA切除。由此产生的ssDNA被RPA快速结合，进一步刺激DNA切除。作为DNA损伤反应（DDR）的一部分，RPA在切除期间被磷酸化。值得注意的是，在细胞实验和体外实验中，pRPA通过抑制BLM解旋酶来抑制DNA切除。 pRPA抑制BLM在DNA末端的起始，促进固有解旋酶的strand-switch活性。这些发现证实了pRPA在DNA切除和DNA损伤反应之间存在一个反馈回路。
在细胞中，pRPA最初不存在，随着DNA切除而开始积累。为了在体外重新记录pRPA积累，研究人员使用单分子荧光技术，通过流动细胞中的RPA-RFP将DNA切除成像10分钟，然后再转换到含有pRPA-GFP的缓冲液中40分钟。这个三色单分子实验允许同时观察BLM/EXO1（通过EXO1荧光标记），RPA-RFP和pRPA-GFP。正如预期的那样，pRPA迅速将ssDNA上的RPA替换掉。引人注目的是，添加pRPA导致32％（n = 29/90）的BLM/EXO1分子停止切除DNA。 剩余的68％的分子比未磷酸化的RPA慢3倍（6±4 bp s 1; n = 61/90）。加入pRPA后BLM/EXO1的进行性也降低了3倍。 pRPA的添加也使36％（n = 15/42）的BLM/DNA2复合物停滞。其余64％的复合物比未磷酸化的RPA慢3倍（6±5 bp s 1; n = 27/42）。从RPA转换为pRPA后，BLM / DNA2切除持续率也降低了3倍。
总的来说，在DNA断裂修复过程中，终止DNA切除对于保持基因组的稳定性至关重要。磷酸化的RPA是BLM解旋酶和DNA切除的负调控因子。由于磷酸化的RPA在切除过程中积累，该研究在DNA切除和终止切除之间建立了一个负反馈回路。
论文链接：
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30358-2
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