共生菌群与转移性黑色素瘤患者的抗PD-1疗效相关

文献简介

共生菌群与转移性黑色素瘤患者的抗PD-1疗效相关

The commensal microbiome is associatedwith anti–PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients

期刊名称：Science   时间：2018年1月5日   IF：37.205

一、摘要

基于抗PD-1的免疫疗法对癌症治疗产生了重大影响，但只惠及了一小部分患者。在可能导致患者间异质性的变量中，患者菌群构成的差异是其中之一，这已被证明会影响临床前小鼠模型的抗肿瘤免疫和免疫治疗效果。我们通过整合16S测序、宏基因组鸟枪法测序和对选定细菌进行q-PCR定量，分析了免疫治疗前转移性黑色素瘤患者的基线粪便样本。观察到共生菌群组成与临床反应之间存在显著的相关性。对疗法有反应的患者含有较丰富的长双歧杆菌、产气柯林斯菌和粪肠球菌。用有反应的患者粪便菌群重建无菌小鼠可以改善肿瘤控制，增强T细胞反应，提高抗PD-L1治疗的疗效。研究结果表明，共生菌群可能对人类癌症患者的抗肿瘤免疫产生机制上的影响。

二、研究背景

以PD-1/PD-L1相互作用为靶点的免疫疗法的治疗效果在基线T细胞炎症性肿瘤微环境的患者中受青睐。因此，调节内源性免疫启动和T细胞浸润肿瘤微环境大小的宿主和肿瘤因子，正在寻求进一步扩大治疗效果的机会。临床前研究指出，小鼠共生菌群的组成可能产生重要的影响，拥有有益菌群的小鼠比含不益菌群的小鼠在抗PD-L1治疗上显示更大的治疗活性，且这种好处可以通过同居或菌群移植进行转移。这些观察结果引发了对人类菌群的类似分析，以评价抗PD-1对癌症患者的治疗效果。

三、研究方法

为了评估共生菌组成是否可能与PD-1阻断免疫治疗的临床疗效有关，该研究招募了42例转移性黑色素瘤患者，大多数患者接受抗PD-1治疗，4例患者接受了抗CTLA-4治疗。根据实体瘤反应评价标准(RECIST) 1.1版，从生物标志物结果中确定临床反应率。

研究收集了这42例转移性黑色素瘤患者治疗前的粪便样本，并提取样品的DNA作为转移性黑色素瘤多维生物标志物分析。该研究整合了三种基于DNA序列的细菌鉴定方法。首先，使用Illumina MiSeq平台对16S V4扩增子进行测序，确定有反应和无反应患者之间不同丰度的OTU。通过本地BLAST比对到NCBI数据库，搜索潜在物种上的差异。其次，采用Illumina NextSeq平台对42个样本中可用的39个DNA样品进行宏基因组鸟枪法测序，将来自16S数据集的OTU与通过宏基因组测序揭示的物种水平身份进行匹配，进一步提高了对物种识别的可信度。最后，用以前验证过的亚群或种特异性的引物和探针，采用qPCR法对宏基因组测序和16S扩增子测序鉴定出的部分细菌种类的丰度进一步测定。

分别将3名有反应和无反应患者的粪便移植给无菌小鼠，移植两周后，给这些小鼠注射B16.SIY肿瘤细胞，在注射肿瘤细胞后7、10、13、16天接种抗PD-L1单克隆抗体，每周测量三次肿瘤的大小，直到预计的终点。同时，收集定植后4周的小鼠粪便样本并提取的DNA，采用16S扩增子测序对菌群组成进行测定。工作流程示意图见图1。

图1工作流程示意图：(A) 微生物鉴定方法；(B)肿瘤相关生物标志物的分析；(C)基于16S测序鉴定的病人粪便样本中的细菌，在调节小鼠黑色素瘤模型的抗肿瘤免疫方面的潜在作用。

四、研究结果

42例患者中16个对疗法有反应，26个无反应，应答率为38%，这与已发表的抗PD-1治疗转移性黑色素瘤患者的临床资料相符。除了以前的吸烟史稍微有差别外，没有观察到有反应和无反应患者的主要差异特征。

16S测序分析发现有62个OTU在有反应和无反应患者之间存在显著差异，有反应患者含量较高的OTU有39个，无反应患者含量较高的OTU有23个，其中一个双歧杆菌科OTU在有反应患者中丰度显著更高。有另一个双歧杆菌科OTU具有临界意义，总共63个OTU纳入分析。这一观察结果概述了我们之前在小鼠中的发现，即双歧杆菌科的成员与提高免疫介导的肿瘤控制和抗PD-L1治疗的疗效相关。各临床分组患者的聚类情况如图2A ，63个有反应和无反应患者差异的OTU的主成分分析(PCA)见图2B。

图2用16S rRNA基因扩增子测序评估对抗PD-1有反应患者和无反应患者中不同的共生菌群。(A)有反应患者和无反应患者差异分类单元的相对丰度；(B)图2A所示的63个差异OTU相对丰度的主成分分析。

宏基因组测序分析将序列注释到微生物数据库，并与16S测序鉴定的63个差异OTU进行最接近的匹配分析。在63个OTU中，有43个被鉴定出了潜在的物种匹配。同时，采用物种特异性定量PCR检测作为鉴定种属的另一种方法。因此，整合三种方法选择了10个在有反应患者和无反应患者中差异富集的物种，这其中8个在有反应患者中丰度更高，分别是：Enterococcusfaecium, Collinsella aerofaciens, Bifidobacterium adolescentis, Klebsiella pneumoniae, Veillonella parvula, Parabacteroides merdae, Lactobacillus sp.和Bifidobacteriumlongum；而有两个在无反应患者中更加丰富：Ruminococcusobeum和Roseburiaintestinalis。

将每位患者潜在的有益的和非有益的OTU总数进行打分，并计算有益和非有益的OTU数的比值。当与RECIST评估的肿瘤大小的绝对变化相对照时，观察到一种清晰的相关性，有益和非有益的OTU数比值超过1.5的患者均表现出临床反应（图3）。这些结果表明，共生菌群的组成可以作为预测检查点阻断治疗反应的生物标志物，并与其他候选预测生物标志物进行比较。

图3每位患者的有益和非有益OTU数比值与患者肿瘤测量值变化之间的关系。虚线标记RECIST%= 30和ratio= 1.5

无菌小鼠的自发免疫介导的肿瘤控制能力降低，使它们适合作为人类菌群的受体。将3个有反应和3个无反应患者的粪便菌群移植到无菌小鼠中，并在两周后植入B16.SIY黑色素瘤细胞。根据肿瘤的生长速度，移植的小鼠分为肿瘤生长较快和生长较慢的两个群体。移植了有反应患者菌群的三组小鼠中有两组基线肿瘤生长较慢，而移植了无反应患者菌群的三组小鼠中有两组基线肿瘤生长较快（图4A）。因此，人类菌群改善小鼠肿瘤控制通常(但并非总是)与供体患者对抗PD -1的临床反应相一致。对一些移植的小鼠接种抗PD-L1单克隆抗体后，每周测量三次肿瘤大小。结果发现抗PD-L1在移植有反应患者菌群的小鼠中效果显著，而在移植无反应患者菌群的小鼠中完全无效(图4B)，这表明共生菌群对体内免疫治疗效果有深远的影响。

图4 在黑色素瘤小鼠模型中，人类菌群调节抗肿瘤免疫。用3个有反应患者(P28、P34和P09)和3个无反应患者(P06、P21和P11)的菌群移植给无菌小鼠。(A) 在移植2周后将B16.SIY黑色素瘤细胞皮下注射到小鼠中，肿瘤生长数据。(B) 测定A组和B组小鼠抗PD-L1治疗的疗效。

四、研究结论

研究表明，患者共生菌群的组成与抗PD-1单克隆抗体的治疗效果有关，共生菌群可能对人类癌症患者的抗肿瘤免疫产生机制上的影响。

五、讨论

单靠菌群移植就能实现较慢的肿瘤生长，这与之前的小鼠研究相似。在该研究中，由于更有益的菌群，将Jackson小鼠的粪便移植到Taconic小鼠体内就足以达到部分治疗效果。该研究中C组和D组的肿瘤控制模式与原患者供体治疗结果不一致，且与原患者供体的菌群组成存在较大差异表明，尽管用人类粪便菌群重建的无菌小鼠通常能表现出人类供体的菌群组成和表型，但在某些情况下，由于存在高度漂移，一些细菌会扩张而另一些则收缩到足以改变表型的程度。尽管如此，对于重新构建的无菌小鼠确实再现了原始供体的临床结果，该模型系统可能有助于最终分离在体内调节抗肿瘤免疫的特定细菌。

虽然长双歧杆菌(B. longum)是目前研究中发现的在小鼠模型中与提高免疫抑制肿瘤有关的一种共生菌，但似乎多种特异性细菌可能有助于提高患者的抗肿瘤免疫。此外，我们目前的队列研究表明，有益的OTU与非有益的OTU数的比例是临床反应的最强预测因子。这可能表明，有益菌的频率越高，与不益细菌的频率越低，结合起来可能获得最有利的临床结果。

已有研究已经确定了共生菌群与抗PD-1单克隆抗体在不同实体癌症中的疗效之间的关系，我们的分组方法和一些分析方法在有反应和无反应两组患者上存在差异。因此，直接比较不同文献中有反应和无反应患者中差异富集的共生菌群应谨慎处理。尽管如此，关于菌群对抗PD-1免疫治疗效果的机制影响已有共识，因为从有反应和无反应患者移植到无菌小鼠的粪便菌群也能够概述出患者的表型。除菌群外，其他肿瘤和宿主因子也明显影响抗肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗的效果。肿瘤内在Wnt/β-catenin通路的激活和Pten基因的缺失或突变已被证明会导致肿瘤微环境T细胞浸润不足，并对检查点阻断免疫治疗产生耐药性，免疫调节基因中的种系多态性也有可能影响自发性抗肿瘤T细胞反应的程度。该研究的结果为将共生菌群组成、肿瘤基因组学和种系遗传学整合到一个多参数模型中开辟了道路，利用该模型可以最大限度地预测哪些患者可能对抗PD-1等免疫疗法产生反应。

DOI：10.1126/science.aao3290

文案：实验部 林爱强

编辑：医学市场部  潘旭兰