前言
癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境的主要成分之一，包括参与肿瘤进展的异质群体。然而，CAF异质性如何由癌细胞控制仍然是模糊的。5月30日日本东京国立癌症中心研究所分子与细胞医学团队在Oncogene上发表了“Cancer extracellular vesicles contribute to stromal heterogeneity by inducing chemokines in cancer-associated fibroblasts”，文章显示癌细胞外囊泡（EVs）在活化的成纤维细胞中诱导一系列趋化因子，并有助于形成异质性。在弥漫型胃癌的异种移植模型中，显示了两种不同的成纤维细胞亚群，其具有α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达或趋化因子表达。EV的微小RNA（miRNA）分析和转染实验表明，几种miRNA在成纤维细胞中诱导趋化因子如CXCL1和CXCL8中起作用，但对于肌纤维母细胞分化则不起作用。临床上，CAF中CXCL1和CXCL8的异常激活与胃癌患者的较差存活相关。因此，CAF中趋化因子表达与肿瘤进展之间的这种联系可为抗癌治疗提供新的靶标。
研究思路
Figure 1:高转移性DGC细胞在体内和体外强烈诱导成纤维细胞中的α-SMA表达。 a 用α-SMA和波形蛋白抗体进行共培养和免疫荧光（IF）分析的示意方案。 b IF的代表性图像。 c 在每种培养条件下定量α-SMA阳性细胞的数量和面积。 d 上图：DGC原位小鼠模型的说明性图片。下图：具有HSC-44PE或44As3的原位小鼠模型的代表性生物发光图像。通过使用IVIS，在接种DGC细胞后2周监测肿瘤进展。 e 小鼠模型中原发性肿瘤的HE（上图），CAM5.2（中图）和α-SMA（下图）染色的代表性显微图像。
Figure 2:高转移性DGC细胞诱导促炎基因和肌成纤维细胞相关基因。 a 基因表达分析的示意图方案。 b 与单培养成纤维细胞相比，与HSC-44PE或44As3共培养的成纤维细胞中差异表达基因的数量。 c 单培养或共培养的成纤维细胞的基因表达的PCA。 d 使用262个选定的基因进行GO分析，这些基因在用44As3培养的成纤维细胞中显着上调。 e 与44As3共培养的成纤维细胞的GSEA与单培养成纤维细胞（Mono）相比，突出了促炎表型。 f 显示每种培养条件下CXCL家族表达的热图。 g 左图：GSEA显示与44As3共培养的成纤维细胞中上皮至间充质转换（EMT）相关基因的富集.右图：显示每种培养条件下EMT相关基因表达的热图。 h EMT基因组中ACTA2，COL4A1和CTGF的表达水平。提出了与HSC-44PE（与PE）或44As3（与As3）共培养的单培养成纤维细胞（Mono）和成纤维细胞。
Figure 3:与高转移性DGC细胞共培养产生两个不同的成纤维细胞亚群。 a IF的代表性图像。 b 每种培养条件下细胞数量的定量。
Figure 4:高转移性DGC细胞衍生的EV诱导趋化因子表达，但不诱导成纤维细胞中的α-SMA表达。a 来自HSC-44PE和44As3的EV电子显微镜图像。 b 纳米粒子跟踪分析显示HSC-44PE EV和44As3 EV的粒度。 c HSC-44PE EV（PE）和44As3 EV（As3）的颗粒数比较。 d HSC-44PE EV（PE）和44As3 EV（As3）中蛋白质含量的比较。 e 传统EV标记的免疫印迹分析。 f 用于癌细胞衍生的EV的iNF-58中基因表达分析的示意性方案。g 显示在具有44As3 EV的iNF-58中546个差异表达的基因。 h 具有44As3 EV的iNF-58的GSEA与具有HSC-44PE EV的iNF-58的GSEA，突出了促炎性表型。 i EVs对iNF-58中CXCL1，CXCL8，ACTA2和COL4A1表达的影响。 j 用PBS（ - ）（PBS），HSC-44PE EV（PE EV）和44As3 EV（As3 EV）在iNF-58的条件培养基中分析CXCL1和CXCL8的ELISA分析。 k EVs对TGF-β处理的iNF-58细胞中CXCL1和CXCL8表达的影响。
Figure 5:EV中的miRNA对诱导成纤维细胞亚群很重要。a 用于HSC-44PE EV和44As3 EV中miRNA表达分析的示意图方案。 b 表明在HSC-44PE EV和44As3 EV之间差异表达的miRNA。 c 显示富含44As3 EV的代表性miRNA图。 d 癌症衍生的EV中代表性miRNA的qRT-PCR分析。e miRNA模拟物转染的iNF-58细胞中CXCL1和CXCL8表达的qRT-PCR分析。 f miRNA模拟物的iNF-58条件培养基中CXCL1和CXCL8分泌的ELISA分析。 g 共培养系统中44As3细胞中miRNA抑制后的CXCL1和CXCL8的ELISA。
Figure 6:CAF亚群中趋化因子的表达与GC进展和患者预后不良密切相关。a 根据CXCL1和CXCL8表达，对GC患者的总体存活概率进行Kaplan-Meier分析。 b Kaplan-Meier根据CXCL8表达分析弥漫型胃癌患者的总生存概率。 c 人类临床胃癌组织样本中CXCL8阳性（存在CXCL8阳性CAF）或CXCL8阴性病例的显微图像。 d Kaplan-Meier分析86例胃癌患者的总生存概率，根据CAFs阳性或阴性CXCL8表达。e 左图：人胃癌中α-SMA，CXCL8和DAPI核复染的代表性免疫荧光图像。右图：更高的放大倍数表明α-SMA-和CXCL8-阳性CAF的分布。
结论
PDGF在CAF的募集和功能中的作用是众所周知的。然而，癌症衍生因子如何控制CAF的功能异质性并形成适当的肿瘤微环境仍然模糊不清。在本研究中，发现了迄今未被认识到的在肿瘤微环境中产生特定成纤维细胞表型的因子。源自高转移性DGC细胞的EV选择性地增强成纤维细胞中趋化因子的表达和产生。有趣的是，只有少数miRNA，包括miR-155，miR-210和miR-193b，在44As3 EV和HSC-44PE EV之间存在差异，表明这种少量的miRNA足以诱导表达趋化因子的表型。研究表明，高转移性DGC细胞衍生的EV强制诱导表达趋化因子的表型，导致在肿瘤微环境中形成CAF的功能异质性。重要的是，只有高转移性癌细胞具有这种潜力，这意味着高度恶性的癌细胞迫使周围的成纤维细胞产生适当的CAF亚群用于其进展和转移。
除了癌细胞衍生趋化因子在癌症进展中的这些重要作用外，研究表明，CAF中的CXCL8与GC患者的GC进展和更差的预后密切相关。虽然无法评估由高转移性DGC细胞培养的成纤维细胞中的所有趋化因子，但研究结果表明，CAF亚群分泌的趋化因子在GC的进展中起着重要作用。然而，来自CAF亚群的趋化因子影响GC转移的确切机制仍然未知。趋化因子不仅有助于促进肿瘤生长和侵袭，还有助于刺激内皮细胞，中性粒细胞和巨噬细胞的生长和迁移。由于啮齿动物缺乏CXCL8基因，因此CAF衍生趋化因子的功能在异种移植肿瘤和临床GC组织之间不可能相同。然而，当观察基因表达微阵列数据时，它清楚地表明许多趋化因子也在与44As3的共培养中上调。特别是，CXCL6的中和抗体减弱了中性粒细胞的趋化性，抑制了小鼠模型中的肿瘤生长和转移。因此，研究结果和先前的研究共同暗示来自CAF亚群的趋化因子协调适当的肿瘤微环境以进行癌症进展和转移。
鉴于TGF-β和EV对成纤维细胞表型产生相反的作用，结果表明EV依赖性和EV非依赖性机制的竞争可能导致CAF的诱导伴随两种基因的表达。然而，由于研究仅限于体外transwell共培养系统，因此可能存在独立于体液因子的其他机制。研究表明，癌细胞和成纤维细胞的直接相互作用导致了具有肌纤维母细胞表型的CAF亚群的诱导。然而，DGC细胞模型显示α-SMA阳性CAF亚群在没有邻分泌相互作用的情况下出现。对CAF诱导的这种差异的简单解释可以是肿瘤细胞类型的差异和肿瘤中成纤维细胞的组织特异性。此外，虽然具有肌纤维母细胞表型的CAF亚群可能对乳腺癌和卵巢癌的癌症进展具有有效的能力，但是没有肌纤维母细胞表型的CAF亚群对于PDAC的进展也是重要的。总的来说，控制CAF亚群的分子机制可能在器官之间不同,应进一步检查以完成阐明组织中CAF异质性的分子机制和功能。
虽然这一证据突出了miRNA在高转移性胃癌细胞EV中对创造肿瘤微环境的重要作用，但对本研究存在一些问题。问题之一是不清楚接受EV的成纤维细胞是否直接分化成表达趋化因子的成纤维细胞。基于体外实验数据，当用PHK-67阳性EV处理成纤维细胞时，观察到约30％的细胞用PKH-67阳性。因此，由于CXCL8阳性成纤维细胞的百分比约为3％，因此并非所有接受EV的细胞都能分化成炎性成纤维细胞。此外，当处理44As3 EV时，无法通过IHC显示CAF异质性。这可能是由于细胞中分泌蛋白的检测限制，或其他分泌因子协同作用以诱导更多趋化因子。此外，无法证明EV中的miRNA介导炎症性CAF亚型的直接证据。尽管由于miRNA抑制可能影响癌细胞表型在技术上难以完全证明，但仍需要进一步研究。
另一个限制是在体内情况下没有癌症EV的功能的直接证据。换句话说，无法显示体内EV转移，尽管其他研究小组使用Cre-loxP系统证明了体内EV转移。根据体外实验，很明显癌症EV具有教育基质细胞，选择性诱导趋化因子表达的能力。由于技术难度，数据未显示癌症EV产生肿瘤微环境并促进的直接证据胃癌的体内进展和转移。为了回答这些关键问题，需要一种能够准确且容易地检测体内EV摄取的新型实验模型。
在本研究中，证明了EV在CAF亚群中的重要作用，并发现EVs对CAF样表型诱导的影响可以与TGF-β明显区分。TGF-β抑制成纤维细胞中趋化因子的表达，但高转移癌细胞衍生的EV恢复趋化因子表达。源自低转移性DGC细胞的EV在TGF-β处理下诱导趋化因子的失败表明源自高转移性癌细胞的EV具有产生具有趋化因子表达的成纤维细胞亚群的有效能力。还鉴定了几种EV miRNA，其显着诱导成纤维细胞中趋化因子的表达。尽管如此，尽管包括TGF-β在内的EV和体液因子可能会影响所有成纤维细胞，但这些miRNA在EV中调节CAF亚群的确切机制仍不清楚。具有分化某些CAF亚群的能力的成纤维细胞可以预先存在于肿瘤微环境中。换句话说，CAF异质性可能主要取决于基质细胞的特性，例如表观遗传状态。
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EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。
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