前言
细胞外囊泡（EV），包括外泌体，调节癌症生物学的多个方面。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）分泌EV，但其分子特征和功能的特征很差。6月4日Swiss实验癌症研究所生命科学学院团队在Cell Reports上发表了“Molecular Profiling and Functional Analysis of Macrophage-Derived Tumor Extracellular Vesicles”，文章报告了从小鼠TAM（TAM-EV）释放的EV的富集，定量和蛋白质组学和脂质组学分析的方法。与源TAM相比，TAM-EV呈现与Th1/M1极化特征相关的分子谱，增强的炎症和免疫应答，以及更有利的患者预后。因此，富集的TAM-EV制剂促进T细胞增殖和离体活化。TAM-EV还含有生物活性脂质和生物合成酶，其可以改变癌细胞中的促炎信号传导。因此，尽管TAM主要是免疫抑制剂，但它们的EV可能具有刺激而非限制抗肿瘤免疫力的潜力。
亮点
1、巨噬细胞在肿瘤中产生丰富的细胞外囊泡
2、巨噬细胞衍生的细胞外囊泡（TAM-EV）
3、显示独特的蛋白质组谱
4、TAM-EV增强癌细胞中的血栓素合成
5、TAM-EV促进而非限制T细胞增殖和激活
研究思路
Figure 1:来自IgG-和抗-CSF1R-处理小鼠的MC38肿瘤EV分离。（A）从IgG-和抗-CSF1R-处理的肿瘤中分离EV的程序。 （B）MC38-肿瘤来源细胞的流式细胞术。 （C）通过BCA测定的蔗糖分馏之前的EV产量。 （D）如（C）中获得的EV的代表性TEM图像。 （E）NTA的EV浓度和粒度分布。 （F）EV蛋白含量和EV浓度之间的相关性，分别由BCA和NTA测定。 （G）来自培养的MC38细胞或MC38肿瘤的细胞和匹配的EV的WB分析。 （H）每种蔗糖级分中的EV蛋白质含量和EV浓度，分别由BCA和NTA测定。 （I）通过NTA的EV浓度和尺寸分布。 （J）通过BCA测定的从蔗糖梯度的第三顶部分回收的EV的产率。 （K）从第三顶部蔗糖级分回收的EV的代表性TEM图像。 （L）蔗糖梯度分级后EV的WB分析。 （M）在蔗糖梯度分级分离后，EV中所选微RNA的Taqman分析。
Figure 2:EV蛋白的富集和交互作用分析。（A）基于LC-MS/MS的蔗糖梯度分离之前和之后的GO富集分析MC38 EV相关蛋白，其倍数变化（FC）丰度> IgG-EV与抗CSF1R-EV的比较为1.7。 （B和C）基于LC-MS/MS的免疫细胞富集（B）和相互作用（C）分析MC38 EV相关蛋白（IgG与抗CSF1R，FC> 1.7）在蔗糖梯度分级后获得。
Figure 3: IgG-EV和抗CSF1R-EV的蛋白质组学分析以及与BMM-EV和MC38-EV的比较。 （A-G）LC-MS/MS和TAM-EV蛋白的分类根据其相关途径。 （H）来自肿瘤，MC38细胞和M2巨噬细胞（BMM）的细胞和EV的WB分析。 （I）EV分离（左）和维恩图（右），比较通过LC-MS/MS在MC38-EV和M1和M2 BMM-EV中检测到的蛋白质。 （J）M1和M2 BMM-EV中的经典巨噬细胞标记物。 （K和L）比较富含IgG-EVs的蛋白质与抗CSF1R-EVs（FC> 1.7; K）或抗CSF1R-EVs与IgG-EVs（FC> 1.7; L）与MC38中检测到的蛋白质相比EV和M1和M2 BMM-EV。 （M）可能来自中性粒细胞的MC38-肿瘤衍生的EV蛋白（抗CSF1R/IgG FC> 1.7）。
Figure 4:通过IP对CD11b+肿瘤衍生的EV进行TAM-EV的定量和TAM-EV蛋白质标记的验证。 （A）从在LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠中生长的MC38肿瘤中分离EV的程序。 （B）在用抗CD9或对照包被的磁珠进行IP后，从LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠中生长的培养的MC38细胞或MC38肿瘤中分离的EV的WB分析。 （C和D）从野生型（WT）或LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠分离的肿瘤-EV的流式细胞术分析。 （E）显示CD11b，ALIX和CD81的定量值的EV的LC-MS/MS分析，通过双向ANOVA，使用Tukey的多重比较测试。 （F）捕获CD11b + EV的IP程序。 （G）与抗CD9，抗CD11b或同种型对照珠结合的PKH67标记的EV的流式细胞术分析。 （H）IP后肿瘤来源的EV的WB分析。 （I）维持IgG-EVs与抗CSF1R-EV的蛋白质与IP后CD11b + IgG-EV中检测到的蛋白质的比较。 （J）报告MC38 TAM-EV特征的62种蛋白质及其与生物途径的关联。 （K）在去除根据CRAPome数据库鉴定的潜在蛋白质污染物后显示（I）中的数据。
Figure 5:TAM-EV的免疫调节谱和功能。（A和B）GSEA显示TAM（TAM-细胞）和TAM-EV蛋白特征与FACS分类M1样或基因表达的基因的相关性。 （C）引发OT-I脾细胞后获得的CD8+T细胞的流式细胞术分析。 （D）（E-G）中所示实验的示意图。 （E和F）通过CellTrace稀释评估的CD8+OT-I增殖的流式细胞术分析。 （E）代表性的流量剖面。 （F）数据的定量。 （G）基于ELISA的由OT-I CD8+T细胞调节的培养基中IFNg的定量。 （H）从C57BL/6小鼠的脾中纯化的CD8+T细胞的流式细胞术分析。 （I）（J和K）中所示实验的示意图。 （J）通过CellTrace稀释评估的CD8+T细胞增殖的流式细胞术分析。 （K）基于ELISA的CD8+T细胞条件培养基中IFNg的定量。 （L）从BALB/c小鼠的脾脏纯化的CD4+T细胞的流式细胞术分析。 （M）（N）中所示实验的示意图。 （N）通过CellTrace稀释评估的CD4+T细胞增殖的流式细胞术分析。 （O）（P）中所示实验的示意图。 （P）CD11b+CD11c + BMDC中活化标记物的流式细胞术分析。
Figure 6:TAM-EV的分子和功能脂质组分图。（A）说明AA代谢的示意图。 （B）EV的LC-MS/MS蛋白质组分析，显示参与类花生酸合成的酶。 （C）来自培养的MC38细胞或MC38肿瘤的细胞和EV的WB分析。 （D）使用内标的校准曲线，通过基于LC-MS/MS的绝对定量测定的AA浓度。 （E）通过基于LC-MS/MS的离子计数的相对定量测定的TXB2浓度。 （F）说明TAM-EV中推定的血栓素合成的示意图。 （G）通过LC-MS/MS脂质组学在MC38肿瘤中定量类二十烷酸，主要是PG（左）及其前体AA（右）。 （H）响应PGE2或PGF2a的CD8+T细胞增殖;左侧面板显示了实验设计。右图显示通过CellTrace稀释评估的CD8+ T细胞增殖的流式细胞术分析。 （I）用PKH67标记的MC38 IgG-EV孵育的MC38细胞的共聚焦分析。 （J）用分离自LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠的EV孵育的MC38细胞的WB分析。 （K）（L-N）中所示实验的示意图。 （L和M）通过LC-MS/MS对MC38细胞条件培养基中的PUFA（L）和类二十烷酸（M）进行定量。 （N）基于ELISA的MC38细胞条件培养基中PGE2和TXB2的定量。
Figure 7:E0771TAM-EV的分子和功能分析。（A）C57BL/6小鼠皮下E0771癌细胞接种和药物施用的时间表。 （B）E0771肿瘤中免疫浸润的流式细胞术分析。 （C）在蔗糖梯度分级之前和之后从E0771肿瘤中回收的EV的产量。 （D）通过NTA在6个蔗糖级分中的EV浓度和粒度分布。 （E）分别通过BCA和NTA测定的每种蔗糖级分中的EV蛋白质含量和EV浓度。 （F）EV的代表性TEM图像。 （G）培养的E0771细胞和匹配的EV的WB分析。 （H和I）E0771肿瘤-EV（H）的WB分析。MRC1，COX1和TBXAS1的相对信号定量在（I）中显示平均条带强度。 （J）比较来自E0771肿瘤的富含IgG-EV的蛋白质与抗CSF1R-EV的蛋白质与MC38 TAM-EV标记的蛋白质。 （K）E0771肿瘤-EV中TBXAS1的LC-MS/MS分析。 （L）基于ELISA的E0771细胞条件培养基中TXB2的定量。
结论
虽然许多研究已经证明了EV介导的生物分子向受体细胞的转移，但最近已经注意到EV异质性的影响。实际上，预期在复杂系统（例如肿瘤或正常组织）中分泌的EV的所有组成成分远远超过培养细胞。例如，发现尽管癌细胞和巨噬细胞的相对丰度在MC38肿瘤中相似，但绝大多数（60％）的EV是TAM衍生的。这表明TAM可能通过膜接触或EV融合和功能分子转移产生大量可影响TME其他细胞类型（包括癌细胞和T细胞）生物学的EV。
在本研究中，对用无关抗体（IgG-EV）或巨噬细胞耗竭抗体2G2（抗CSF1R-EV）处理的MC38结肠直肠肿瘤分泌的EV的蛋白质组进行了比较分析。通过比较数据，编制了TAM EV相关蛋白的列表，通过实施基于CD11b + - 骨髓细胞衍生的EV的阳性选择的IP策略进一步细化。得到的数据集鉴定了62种蛋白质的TAM-EV特征，其中许多蛋白质在来自培养的巨噬细胞的EV中未检测到。值得注意的是，在从E0771乳腺癌分离的TAM-EV中也检测到超过三分之一的MC38 TAM-EVsignature蛋白。
与ER隔室相关的蛋白质，例如CANX和GP96，通常被认为是EV制剂的污染物。在蔗糖梯度分级后，在肿瘤衍生的EV制剂中检测到ER蛋白，这应该分离出真正的EV和ER囊泡，以及CD9+的直接IP后EVs。与Steenbeek等人的研究结果一致，使用基于酶组织消化的方案检测了肿瘤来源的EV中的ER相关蛋白。有趣的是，在相同的酶促过程后，在脑源性EV中未检测到ER蛋白，提示TME中的EV库可能与神经组织的EV库不同。尽管MC38肿瘤含有小比例的非活细胞，但是肿瘤衍生的EV也可能包括小的凋亡小体和来自晚期内体或ER的其他膜囊泡。一些研究已经描述了ER和晚期内体膜之间的接触位点以及一些ER蛋白在细胞应激和死亡过程中转移到质膜。这些过程可能在炎症性TME中加剧并且可能促进携带来自各种蛋白质的EV的释放。
检测到了几种免疫反应的正调节因子，包括模式识别受体如STING和参与TLR信号传导的多种蛋白质。TAM-EV标记还包含DOCK（'胞质分裂的'献血者'）家族的成员，其是涉及细胞内信号传导网络，趋化性和免疫性的鸟嘌呤核苷酸交换因子。有趣的是，DOCK2与其伴侣ELMO1一起介导淋巴细胞的激活和募集。此外，还在TAM-EV特征中检测到ITGA4和F11R，其参与脑肿瘤中的白细胞粘附和迁移。与免疫抑制性M2样TAM相比，TAM-EV特征与免疫刺激性M1样基因表达谱更强烈相关。此外，TAM-EV蛋白与癌症患者的良好预后相关，而在源TAM中特异性表达的蛋白质与良好或不良临床结果相关。最后，富含TAM-EV的EV制剂增强T细胞增殖和离体IFNg产生，而从TAM耗尽的肿瘤获得的EV制剂既不抑制也不活化T细胞。总的来说，TME中TAM调节的免疫调节电路也可能涉及分泌的EV传递的激活信号。从抗原呈递细胞分离的EV携带MHC-肽复合物和TLR配体，其可以直接激活CD4 +和CD8 + T细胞。然而，涉及TAM-EV直接激活T细胞的机制需要进一步研究。
与源TAM相比，TAM产生多种免疫调节脂质，并且参与脂质代谢的几种蛋白质富含TAM-EV。在TAM-EV中发现了某些AA途径的酶，而其他似乎与癌细胞衍生的EV或其他细胞相关。TME中的来源，无论是否存在TAM。值得注意的是，观察到TAM-EV包含生产TX所需的机制。该发现表明TAM-EV-货物转移至肿瘤相关细胞可能调节AA衍生的脂质介质的生物合成.TAM消耗显着增加几种原始PG的水平，包括PGF2a和PGE2，其主要通过COX2产生。虽然这种增加可能是由于TAM耗尽后产生PG的癌细胞的比例扩大所致，但结果表明TAM-EV可以直接限制某些PG的产生并增加体外MC38和E0771癌细胞的TX分泌。因此，TAM-EV可以将AA分解代谢从COX2依赖性途径重定向至COX1依赖性途径，以可能限制一些PG的原始效应。在IP或FACS后恢复纯TAM EV制剂的困难限制了小鼠的功能研究。尽管如此，本研究中提出的TAM-EV蛋白质特征和脂质组学数据集可以作为进一步研究TAM衍生的EV在TME中作用的跳板。
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提取码: tk1q
EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。
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