前言
细胞外囊泡(EV),包括外泌体,调节癌症生物学的多个方面。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)分泌EV,但其分子特征和功能的特征很差。6月4日Swiss实验癌症研究所生命科学学院团队在Cell Reports上发表了“Molecular Profiling and Functional Analysis of Macrophage-Derived Tumor Extracellular Vesicles”,文章报告了从小鼠TAM(TAM-EV)释放的EV的富集,定量和蛋白质组学和脂质组学分析的方法。与源TAM相比,TAM-EV呈现与Th1/M1极化特征相关的分子谱,增强的炎症和免疫应答,以及更有利的患者预后。因此,富集的TAM-EV制剂促进T细胞增殖和离体活化。TAM-EV还含有生物活性脂质和生物合成酶,其可以改变癌细胞中的促炎信号传导。因此,尽管TAM主要是免疫抑制剂,但它们的EV可能具有刺激而非限制抗肿瘤免疫力的潜力。
亮点
1、巨噬细胞在肿瘤中产生丰富的细胞外囊泡
2、巨噬细胞衍生的细胞外囊泡(TAM-EV)
3、显示独特的蛋白质组谱
4、TAM-EV增强癌细胞中的血栓素合成
5、TAM-EV促进而非限制T细胞增殖和激活
研究思路
Figure 1:来自IgG-和抗-CSF1R-处理小鼠的MC38肿瘤EV分离。(A)从IgG-和抗-CSF1R-处理的肿瘤中分离EV的程序。 (B)MC38-肿瘤来源细胞的流式细胞术。 (C)通过BCA测定的蔗糖分馏之前的EV产量。 (D)如(C)中获得的EV的代表性TEM图像。 (E)NTA的EV浓度和粒度分布。 (F)EV蛋白含量和EV浓度之间的相关性,分别由BCA和NTA测定。 (G)来自培养的MC38细胞或MC38肿瘤的细胞和匹配的EV的WB分析。 (H)每种蔗糖级分中的EV蛋白质含量和EV浓度,分别由BCA和NTA测定。 (I)通过NTA的EV浓度和尺寸分布。 (J)通过BCA测定的从蔗糖梯度的第三顶部分回收的EV的产率。 (K)从第三顶部蔗糖级分回收的EV的代表性TEM图像。 (L)蔗糖梯度分级后EV的WB分析。 (M)在蔗糖梯度分级分离后,EV中所选微RNA的Taqman分析。
Figure 2:EV蛋白的富集和交互作用分析。(A)基于LC-MS/MS的蔗糖梯度分离之前和之后的GO富集分析MC38 EV相关蛋白,其倍数变化(FC)丰度> IgG-EV与抗CSF1R-EV的比较为1.7。 (B和C)基于LC-MS/MS的免疫细胞富集(B)和相互作用(C)分析MC38 EV相关蛋白(IgG与抗CSF1R,FC> 1.7)在蔗糖梯度分级后获得。
Figure 3: IgG-EV和抗CSF1R-EV的蛋白质组学分析以及与BMM-EV和MC38-EV的比较。 (A-G)LC-MS/MS和TAM-EV蛋白的分类根据其相关途径。 (H)来自肿瘤,MC38细胞和M2巨噬细胞(BMM)的细胞和EV的WB分析。 (I)EV分离(左)和维恩图(右),比较通过LC-MS/MS在MC38-EV和M1和M2 BMM-EV中检测到的蛋白质。 (J)M1和M2 BMM-EV中的经典巨噬细胞标记物。 (K和L)比较富含IgG-EVs的蛋白质与抗CSF1R-EVs(FC> 1.7; K)或抗CSF1R-EVs与IgG-EVs(FC> 1.7; L)与MC38中检测到的蛋白质相比EV和M1和M2 BMM-EV。 (M)可能来自中性粒细胞的MC38-肿瘤衍生的EV蛋白(抗CSF1R/IgG FC> 1.7)。
Figure 4:通过IP对CD11b+肿瘤衍生的EV进行TAM-EV的定量和TAM-EV蛋白质标记的验证。 (A)从在LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠中生长的MC38肿瘤中分离EV的程序。 (B)在用抗CD9或对照包被的磁珠进行IP后,从LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠中生长的培养的MC38细胞或MC38肿瘤中分离的EV的WB分析。 (C和D)从野生型(WT)或LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠分离的肿瘤-EV的流式细胞术分析。 (E)显示CD11b,ALIX和CD81的定量值的EV的LC-MS/MS分析,通过双向ANOVA,使用Tukey的多重比较测试。 (F)捕获CD11b + EV的IP程序。 (G)与抗CD9,抗CD11b或同种型对照珠结合的PKH67标记的EV的流式细胞术分析。 (H)IP后肿瘤来源的EV的WB分析。 (I)维持IgG-EVs与抗CSF1R-EV的蛋白质与IP后CD11b + IgG-EV中检测到的蛋白质的比较。 (J)报告MC38 TAM-EV特征的62种蛋白质及其与生物途径的关联。 (K)在去除根据CRAPome数据库鉴定的潜在蛋白质污染物后显示(I)中的数据。
Figure 5:TAM-EV的免疫调节谱和功能。(A和B)GSEA显示TAM(TAM-细胞)和TAM-EV蛋白特征与FACS分类M1样或基因表达的基因的相关性。 (C)引发OT-I脾细胞后获得的CD8+T细胞的流式细胞术分析。 (D)(E-G)中所示实验的示意图。 (E和F)通过CellTrace稀释评估的CD8+OT-I增殖的流式细胞术分析。 (E)代表性的流量剖面。 (F)数据的定量。 (G)基于ELISA的由OT-I CD8+T细胞调节的培养基中IFNg的定量。 (H)从C57BL/6小鼠的脾中纯化的CD8+T细胞的流式细胞术分析。 (I)(J和K)中所示实验的示意图。 (J)通过CellTrace稀释评估的CD8+T细胞增殖的流式细胞术分析。 (K)基于ELISA的CD8+T细胞条件培养基中IFNg的定量。 (L)从BALB/c小鼠的脾脏纯化的CD4+T细胞的流式细胞术分析。 (M)(N)中所示实验的示意图。 (N)通过CellTrace稀释评估的CD4+T细胞增殖的流式细胞术分析。 (O)(P)中所示实验的示意图。 (P)CD11b+CD11c + BMDC中活化标记物的流式细胞术分析。
Figure 6:TAM-EV的分子和功能脂质组分图。(A)说明AA代谢的示意图。 (B)EV的LC-MS/MS蛋白质组分析,显示参与类花生酸合成的酶。 (C)来自培养的MC38细胞或MC38肿瘤的细胞和EV的WB分析。 (D)使用内标的校准曲线,通过基于LC-MS/MS的绝对定量测定的AA浓度。 (E)通过基于LC-MS/MS的离子计数的相对定量测定的TXB2浓度。 (F)说明TAM-EV中推定的血栓素合成的示意图。 (G)通过LC-MS/MS脂质组学在MC38肿瘤中定量类二十烷酸,主要是PG(左)及其前体AA(右)。 (H)响应PGE2或PGF2a的CD8+T细胞增殖;左侧面板显示了实验设计。右图显示通过CellTrace稀释评估的CD8+ T细胞增殖的流式细胞术分析。 (I)用PKH67标记的MC38 IgG-EV孵育的MC38细胞的共聚焦分析。 (J)用分离自LysM.Cre/ROSAmT/mG小鼠的EV孵育的MC38细胞的WB分析。 (K)(L-N)中所示实验的示意图。 (L和M)通过LC-MS/MS对MC38细胞条件培养基中的PUFA(L)和类二十烷酸(M)进行定量。 (N)基于ELISA的MC38细胞条件培养基中PGE2和TXB2的定量。
Figure 7:E0771TAM-EV的分子和功能分析。(A)C57BL/6小鼠皮下E0771癌细胞接种和药物施用的时间表。 (B)E0771肿瘤中免疫浸润的流式细胞术分析。 (C)在蔗糖梯度分级之前和之后从E0771肿瘤中回收的EV的产量。 (D)通过NTA在6个蔗糖级分中的EV浓度和粒度分布。 (E)分别通过BCA和NTA测定的每种蔗糖级分中的EV蛋白质含量和EV浓度。 (F)EV的代表性TEM图像。 (G)培养的E0771细胞和匹配的EV的WB分析。 (H和I)E0771肿瘤-EV(H)的WB分析。MRC1,COX1和TBXAS1的相对信号定量在(I)中显示平均条带强度。 (J)比较来自E0771肿瘤的富含IgG-EV的蛋白质与抗CSF1R-EV的蛋白质与MC38 TAM-EV标记的蛋白质。 (K)E0771肿瘤-EV中TBXAS1的LC-MS/MS分析。 (L)基于ELISA的E0771细胞条件培养基中TXB2的定量。
结论
虽然许多研究已经证明了EV介导的生物分子向受体细胞的转移,但最近已经注意到EV异质性的影响。实际上,预期在复杂系统(例如肿瘤或正常组织)中分泌的EV的所有组成成分远远超过培养细胞。例如,发现尽管癌细胞和巨噬细胞的相对丰度在MC38肿瘤中相似,但绝大多数(60%)的EV是TAM衍生的。这表明TAM可能通过膜接触或EV融合和功能分子转移产生大量可影响TME其他细胞类型(包括癌细胞和T细胞)生物学的EV。
在本研究中,对用无关抗体(IgG-EV)或巨噬细胞耗竭抗体2G2(抗CSF1R-EV)处理的MC38结肠直肠肿瘤分泌的EV的蛋白质组进行了比较分析。通过比较数据,编制了TAM EV相关蛋白的列表,通过实施基于CD11b + - 骨髓细胞衍生的EV的阳性选择的IP策略进一步细化。得到的数据集鉴定了62种蛋白质的TAM-EV特征,其中许多蛋白质在来自培养的巨噬细胞的EV中未检测到。值得注意的是,在从E0771乳腺癌分离的TAM-EV中也检测到超过三分之一的MC38 TAM-EVsignature蛋白。
与ER隔室相关的蛋白质,例如CANX和GP96,通常被认为是EV制剂的污染物。在蔗糖梯度分级后,在肿瘤衍生的EV制剂中检测到ER蛋白,这应该分离出真正的EV和ER囊泡,以及CD9+的直接IP后EVs。与Steenbeek等人的研究结果一致,使用基于酶组织消化的方案检测了肿瘤来源的EV中的ER相关蛋白。有趣的是,在相同的酶促过程后,在脑源性EV中未检测到ER蛋白,提示TME中的EV库可能与神经组织的EV库不同。尽管MC38肿瘤含有小比例的非活细胞,但是肿瘤衍生的EV也可能包括小的凋亡小体和来自晚期内体或ER的其他膜囊泡。一些研究已经描述了ER和晚期内体膜之间的接触位点以及一些ER蛋白在细胞应激和死亡过程中转移到质膜。这些过程可能在炎症性TME中加剧并且可能促进携带来自各种蛋白质的EV的释放。
检测到了几种免疫反应的正调节因子,包括模式识别受体如STING和参与TLR信号传导的多种蛋白质。TAM-EV标记还包含DOCK('胞质分裂的'献血者')家族的成员,其是涉及细胞内信号传导网络,趋化性和免疫性的鸟嘌呤核苷酸交换因子。有趣的是,DOCK2与其伴侣ELMO1一起介导淋巴细胞的激活和募集。此外,还在TAM-EV特征中检测到ITGA4和F11R,其参与脑肿瘤中的白细胞粘附和迁移。与免疫抑制性M2样TAM相比,TAM-EV特征与免疫刺激性M1样基因表达谱更强烈相关。此外,TAM-EV蛋白与癌症患者的良好预后相关,而在源TAM中特异性表达的蛋白质与良好或不良临床结果相关。最后,富含TAM-EV的EV制剂增强T细胞增殖和离体IFNg产生,而从TAM耗尽的肿瘤获得的EV制剂既不抑制也不活化T细胞。总的来说,TME中TAM调节的免疫调节电路也可能涉及分泌的EV传递的激活信号。从抗原呈递细胞分离的EV携带MHC-肽复合物和TLR配体,其可以直接激活CD4 +和CD8 + T细胞。然而,涉及TAM-EV直接激活T细胞的机制需要进一步研究。
与源TAM相比,TAM产生多种免疫调节脂质,并且参与脂质代谢的几种蛋白质富含TAM-EV。在TAM-EV中发现了某些AA途径的酶,而其他似乎与癌细胞衍生的EV或其他细胞相关。TME中的来源,无论是否存在TAM。值得注意的是,观察到TAM-EV包含生产TX所需的机制。该发现表明TAM-EV-货物转移至肿瘤相关细胞可能调节AA衍生的脂质介质的生物合成.TAM消耗显着增加几种原始PG的水平,包括PGF2a和PGE2,其主要通过COX2产生。虽然这种增加可能是由于TAM耗尽后产生PG的癌细胞的比例扩大所致,但结果表明TAM-EV可以直接限制某些PG的产生并增加体外MC38和E0771癌细胞的TX分泌。因此,TAM-EV可以将AA分解代谢从COX2依赖性途径重定向至COX1依赖性途径,以可能限制一些PG的原始效应。在IP或FACS后恢复纯TAM EV制剂的困难限制了小鼠的功能研究。尽管如此,本研究中提出的TAM-EV蛋白质特征和脂质组学数据集可以作为进一步研究TAM衍生的EV在TME中作用的跳板。
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提取码: tk1q
EVs-Exosomes由苏大,浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。
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