Cell Stem Cell | 单细胞转录组分析：揭示人成纤维细胞向心肌细胞转化的命运蓝图

以心肌梗死为代表的心血管疾病是人类健康的头号杀手，由于其造成的永久性的、不可逆的心肌细胞损伤，至今未发展出有效的治疗方案。因此，研究和发现一种有效的使心肌细胞能够再生，替代和修复受损心脏组织的方法将为心脏病患者带去治愈疾病的希望。

近年来广受关注的直接心肌细胞重编程（direct cardiac reprogramming）方法，是最有希望实现体内直接心脏损伤修复的方法之一。该方法已经被报道，能够在体内和体外的系统中，通过病毒转导重要的转录因子直接将心脏中的非心肌细胞转化为功能性的诱导心肌细胞（induced cardiomyocytes, iCMs），从而缩小瘢痕组织并且改善受损的心脏功能【1-3】。然而，该领域的绝大多数研究都是使用模式动物——小鼠作为研究模型，仅有的在人体细胞中的研究表明：人心肌细胞的直接重编程的方法更复杂，效率更低，需要的转化过程更长，得到的心肌细胞功能相对不成熟；并且其细胞命运转化的分子调控网络尚未知。

2019年6月20日，北卡罗来纳大学（UNC）的周阳博士和刘子青博士等在心肌细胞重编程领域开创者之一钱莉教授的带领下在Cell Stem Cell发表了题为Single Cell Transcriptomic Analysis of Cell Fate Transitions during Human Cardiac Reprogramming的研究论文。该论文从单细胞水平描绘了人心肌细胞重编程过程中转录组随着细胞命运转化而发生的改变。研究人员还利用多种统计方法和计算机算法评估了这一转变过程：揭示了细胞命运分叉的“决策点”（decision point），同时预测并且验证了有重要功能的调控因子。

研究人员首先报道了优化的人心肌细胞重编程的方法，利用最精简的重编程因子达到了高效的重编程效果（～50%的转化细胞表达心肌细胞的标记分子cTnT）。为了研究重编程过程中人心肌细胞的动态调控过程，研究人员在多个时间点（第0，3，5，7，9天）收集重编程过程中的细胞，利用单细胞测序详细描绘了人心肌细胞重编程过程中转录组的动态变化和细胞命运的二项选择（bifurcated trajectory），即在成纤维细胞向心肌转化的早期诱导阶段存在一个“决策点”（decision point），决定了细胞的命运能否成功地被转化。根据细胞的命运，研究人员将了心肌细胞重编程过程中分为响应途径（reprogramming route）和非响应途径（refractory route）：沿着重编程非响应途径，成纤维细胞会对重编程因子做出应激反应，且最终回归到起始的成纤维细胞命运状态；相反，沿着重编程响应途径，细胞逐渐关闭成纤维状态相关的基因转录，并且大规模地激活心肌细胞所需的转录调控网络。

除了描绘整体的重编程图谱外，通过深度挖掘单细胞转录组数据，该研究还为进一步了解人心肌细胞重编程的分子机制提供了大量的线索和研究方向。结合RNA干扰介导的功能实验和筛选，研究人员阐述了病毒介导的免疫反应在人心肌细胞重编程过程中是必不可少的，并且其调控机制和DNA甲基化有关。另外，通过表达谱的相关性分析，多个未知功能的基因沉默被报道可以替代重编程因子之一参与细胞命运的转变。同时，基于重编程响应和非响应途径的差异基因比对，作者还寻找到了正向和反向的分子标记物，将来可用于筛选和富集转化的心肌细胞。

另外，结合钱莉团队于2017年在Nature发表的小鼠心肌细胞重编程图谱【4】，作者利用自建的Cell Fate Index算法对比揭示了心肌细胞重编程在不同种属之间的共性和差异。无论小鼠还是人的重编程都分三个阶段：1）早期对重编程因子的快速响应时期，2）中期克服转化障碍的慢速时期，以及3）晚期加快的心肌命运决定期。然而，人心肌细胞重编程过程中转录组改变的程度和速度都不及小鼠心肌细胞重编程。进一步研究指出，该差异主要体现在缺失心肌细胞成熟所必需的细胞连接（cell junction）和离子通道（ion channel）相关的基因表达。该算法旨在简化和评估细胞命运转变过程中的进度，预计可以广泛运用在其他细胞重编程或者分化过程的研究中。

综上所述，该论文详细描绘了人成纤维细胞向心肌细胞转化的命运图谱，为深入理解心肌细胞再生和细胞命运决定提供了蓝图，并且为该技术的临床应用转化迈出了第一步；同时，本文还展现了综合运用生物学实验，统计学分析以及计算机建模等多学科的方法，深入挖掘单细胞转录组的数据，从而为揭示深层的分子机制提供崭新的思路。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.05.020

制版人：珂

参考文献

1. Qian L, Huang Y, Spencer CI, et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature 2012;485:593–598.

2. Song K, Nam Y, Luo X, et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature 2012;485:599–604.

3. Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 2010;142:375–386.

4. Liu Z, Wang L, Welch JD, et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature 2017;551:100–104.