马钱子生物碱类成分在MDCK-MDR1单层细胞模型中的转运机制研究

摘  要：目的 研究马钱子碱、士的宁在MDCK-MDR1单层细胞模型中的双向转运机制。方法 MTT法确定马钱子碱、士的宁对MDCK-MDR1单层细胞毒性范围，以MDCK-MDR1单层细胞为体外研究模型，考察转运时间、药物作用质量浓度、P-糖蛋白（P-gp）抑制剂维拉帕米对马钱子碱、士的宁的累积吸收浓度（C_cum）和表观渗透系数（P_app）的影响。结果 马钱子碱和士的宁P_app均＞1×10⁻⁵ cm/s，P_app(BL→AP)/P_app(AP→BL)均＜2。马钱子碱、士的宁与维拉帕米合用，显著降低了P_app(BL→AP)/P_app(AP→BL)值。结论  马钱子碱、士的宁以被动转运为主，P-gp抑制剂维拉帕米对其吸收有明显抑制作用，马钱子碱、士的宁可能是P-gp底物。

马钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomicaL. 的干燥成熟种子，马钱子碱和士的宁是马钱子中主要的有效成分，同时也有较强的毒副作用^[1]，且马钱子的治疗剂量与中毒剂量较接近，治疗窗较为狭窄，限制了马钱子的广泛使用。本研究以MDCK- MDR1细胞为模型，该模型是将人类的MDR1（multidrug resistance gene 1）基因转染到MDCK（Madin-Darbycanine kidney）细胞上产生的^[2-3]。多药耐药蛋白（MDR1），也称为P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）或ATP结合盒亚家族B成员（ABCB1），是一种外排运输系统，可选择性地将基质从脑脊液转运至血液，因此限制了血液中的物质进入脑部。MDCK-MDR1细胞可作为血脑屏障（blood brain barrier，BBB）药物快速筛选模型^[4]，该细胞系可以用来快速筛选P-gp的底物和抑制剂。P-gp是一种能量依赖性药物外排泵，将许多药物外排到细胞外，从而影响药物疗效，通过文献查阅，马钱子碱和士的宁表现出较高的脑渗透性^[5-6]。BBB是脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障^[7-9]。因此，本研究采用P-gp高表达的MDCK-MDR1的细胞模型来研究马钱子碱、士的宁的双向跨膜转运特性，明确马钱子中主要活性成分马钱子碱和士的宁的吸收转运机制，为临床的合理用药提供依据。

1  材料

1.1  细胞

MDCK-MDR1细胞购自上海中亚生物基因研究所，实验中所用的细胞代数为16～22代。

1.2  药物

1.3  试剂

1.4  仪器

倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；ThermoForma 3111细胞培养箱、酶标仪（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；T-75培养瓶、3460transwell板（美国Corning公司）；BSA124S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；IKA genius3旋涡混合器（德国IKA集团）；KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）。

2  方法与结果

2.1  马钱子碱和士的宁的测定

2.1.1  对照品溶液的配制  精密称定马钱子碱对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容；精密称定士的宁对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容。

2.1.2  色谱及质谱条件  色谱柱为ACE UltraCore Super C₁₈ 100A（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），流动相为10 mmol/L醋酸铵＋0.04%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～0.01 min，95% A；0.01～1 min，95%～87% A；1.0～2.5 min，87%～85% A；2.5～4.1 min，85% A；4.1～5.0 min，85%～60% A；5.0～5.1 min，60%～40% A；5.1～7.1 min，40% A；7.1～7.2 min，40%～95% A；体积流量0.35 mL/min，进样量5 μL，柱温30 ℃。正离子检测，MRM模式，用于定量的离子对为马钱子碱m/z 395.3/324.4，DP为130 V，CE为43 eV；士的宁m/z 335.2/184.2，DP为140 V，CE为51 eV；苦参碱m/z 249.3/148.3，DP为140 V，CE为48 eV。色谱图见图1。

2.1.3  样品处理方法  在150 μL转运分析样品中加入30 μL苦参碱甲醇溶液（40 ng/mL，内标），再加入120 μL甲醇，涡旋2 min，以16 000 r/min转速离心20 min，取上清液用于进样分析。

2.1.4  标准曲线的绘制  按“2.1.1”项下配制的马钱子碱和士的宁对照品母液分别用HBSS稀释成124.00、62.00、31.00、15.50、7.75、3.88、1.94、0.97、0.48 ng/mL系列溶液，按照“2.1.3”项下的样品处理方法处理后进行液质检测。得到回归方程，马钱子碱：Y＝0.094 5，r²＝0.997 9。

2.1.5  专属性考察  将空白HBSS液加入内标、空白HBSS液加入马钱子碱、空白HBSS液加入士的宁、空白转运液、给药后加入内标的转运液按照“2.1.3”项下的样品处理方法处理后进行液质检测。结果表明，HBSS、细胞代谢物、维拉帕米对马钱子碱与士的宁的检测无干扰，本方法专属性良好。

2.1.7 稳定性考察  “2.1.1”项下配制的马钱子碱和士的宁对照品母液分别用HBSS稀释成质量浓度为62.00、15.50、3.88 ng/mL的马钱子碱、士的宁对照品溶液，考察样品室温放置48 h、−20 ℃ 放置30 d的稳定性，每一质量浓度6个样本，按照“2.1.3”项下的样品处理方法处理后进行液质检测。结果测得马钱子碱、士的宁室温放置48h、−20 ℃放置30 d均稳定，符合生物样品分析要求。结果见表2。

2.1.8  基质效应 精密称取马钱子碱、士的宁对照品，用空白细胞转运液稀释为高、中、低质量浓度（62.00、15.50、3.88 ng/mL）的马钱子碱、士的宁对照品溶液，按照“2.1.3”项下的样品处理方法处理后进行液质检测，记录峰面积为A；“2.1.1”项下配制的马钱子碱、士的宁对照品母液，用空白HBSS溶液稀释为质量浓度62.00、15.50、3.88 ng/mL的马钱子碱、士的宁对照品溶液，按照“2.1.3”项下的样品处理方法处理后进行液质检测，记录峰面积。

2.1.9  回收率 分别精密量取马钱子碱、士的宁对照品溶液，用空白HBSS液稀释为质量浓度62.00、15.50、3.88 ng/mL的马钱子碱、士的宁对照品溶液，每个质量浓度平行测定6次，根据标准曲线计算质量浓度。以测定质量浓度与配制质量浓度的比值计算方法回收率。结果马钱子碱的回收率为96.77%～101.93%，RSD为1.21%～4.69%；士的宁的回收率为94.19%～103.87%，RSD为0.66%～4.36%。

2.1.10  定量限与检测限  精密量取一定量的马钱子碱、士的宁，将其逐级稀释，当测定的信噪比为10时，其对应对照品的质量浓度即为最低定量限；当测定的信噪比为3时，其对应混合对照品的质量浓度即为最低检限。结果表明，马钱子碱定量限为0.24 ng/mL，士的宁定量限为0.06 ng/mL，马钱子碱检测限为0.03 ng/mL，士的宁检测限为0.03 ng/mL。

2.2.1  统计学处理  数据采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。

2.2.2  MTT比色法测定马钱子碱、士的宁对MDCK-MDR1细胞的安全毒性范围  取对数生长期的 MDCK-MDR1细胞，用0.25% EDTA-胰酶消化，完全培养液洗涤离心（1 000 r/min，5 min），调整细胞密度为5×10⁴个/L，接种于96孔细胞培养板，每孔中加入200μL细胞悬液，培养24 h使细胞贴壁后，分别加入200 μL不同质量浓度的马钱子碱和士的宁药液（药液现配现用，称取适量对照品，加入体积分数小于0.1%的DMSO，用高糖型DMEM培养液稀释）。每个样品设6个复孔。另设含细胞不加药物的培养液作为对照组，不含细胞的培养液作为空白对照组。给药培养4 h后，每孔加入含5 mg/mLMTT的工作液20 μL；培养4 h后，除去MTT工作液，每孔加DMSO150 μL，摇床摇匀，室温、避光孵育10min，在波长490 nm处用酶标仪测定吸光度（A）值。计算细胞存活率。

细胞存活率＝(A_给药—A_空白)/(A_对照—A_空白)

MTT比色法测定结果见表3，马钱子碱对MDCK-MDR1细胞无毒质量浓度为0～0.10 μg/mL，士的宁对MDCK-MDR1细胞的无毒质量范围为0～0.04 μg/mL，故分别在无毒质量浓度范围内进行转运实验。

2.2.3  MDCK-MDR1细胞单层模型的制备  MDCK-MDR1细胞接种在T-75培养瓶中，培养液为高糖型DMEM，当细胞生长融合至80%～90%时，用0.25% EDTA胰酶消化，离心，用新鲜培养液制备成混合均匀的细胞悬液，并用细胞计数器计数，调节细胞密度为2.0×10⁵个/mL，接种在12孔Transwell培养皿中。在每孔绒毛面（AP侧）加入0.5 mL细胞悬液，基底面（BL侧）加入1.5 mL空白培养液，置于培养箱中培养48 h后，在AP和BL两侧均更换新鲜培养液，每天换液，连续培养9 d。本实验采用荧光素钠渗漏和跨膜电阻值来评价细胞模型的紧密性和完整性，当跨膜电阻（TEER）值大于300 Ω∙cm²时，可认为该状态下的细胞单层是致密完整的^[10-12]。TEER值越高，表示细胞单层连接得越紧密。当荧光素钠在MDCK-MDR1单层细胞的透过量小于1.0%，可认为MDCK-MDR1单层细胞的紧密型和完整性良好，细胞模型建立成功。MDCK-MDR1单层细胞的TEER值计算公式如下：TEER＝(R－R_b)×A，其中R为接种了细胞的Transwell孔测量电阻值，R_b为没有接种细胞的空白Transwell孔测量电阻值，A为多聚碳酸酯膜的膜面积。本实验测定结果见图2、3。连续培养9 d后，TEER大于500 Ω∙cm²，空白Transwell孔的荧光素钠透过量在150 min时累积透过率为52.45%，接种MDCK-MDR1细胞的荧光素钠在150 min时累积透过率为0.68%，小于1%，表明该细胞模型的紧密性和完整性良好，可用于评价药物的转运情况。

2.2.4  双向转运实验  进行转运实验前，用37 ℃空白HBSS溶液清洗细胞单层膜3次，再放入CO₂培养箱，于37 ℃用HBSS溶液平衡30 min。（1）AP→BL侧的转运：将0.5 mL各质量浓度的供试液（供试液现配现用，称取适量对照品，加入体积分数小于0.1%的DMSO，用空白HBSS溶液稀释）加到AP侧作为供给池，同时BL侧加入1.5 mL空白HBSS溶液作为接收池。待取样时在BL侧取样0.3 mL于离心管中，取样后在BL侧加入0.3 mL空白HBSS，转运样品用甲醇沉淀蛋白后用于LC-MS检测。（2）BL→AP侧的转运：将1.5 mL各质量浓度的供试液加到BL侧作为供给池，同时AP侧加入0.5 mL空白HBSS溶液作为接收池。待取样时在AP侧取样0.3 mL于离心管中，取样后在AP侧加入0.3 mL空白HBSS，转运样品用甲醇沉淀蛋白后用于LC-MS检测。（3）用LC-MS/MS测定药物的吸收量。分别考察转运时间、质量浓度以及P-gp抑制剂维拉帕米对马钱子碱、士的宁双向转运吸收的影响。

2.2.5 数据处理  由于每次取样后都要补液，对药物的通透产生了稀释作用，因而要对药物的累积吸收浓度（C_cum）进行校正。按公式计算C_cum、药物累积转运量、累积转运率、表观渗透系数（P_app）、外排率（ER）。

药物累积转运量＝C_cum×V_sn

累积转运率＝120 min累积转运量/实际给药量

P_app＝∆Q/(∆t×A×C₀)

ER＝P_app(BL→AP)/P_app(AP→BL)

C_cum为药物的累积吸收浓度，A_n为第n个样品渗透浓度，V_sn为第n个样品的采集体积，V为接收池的体积，ΔQ表示转运时间Δt内的药物转运速率，C₀为取样所在面的初始质量浓度，A为聚碳酯膜的表面积

2.2.6  转运实验结果  BL→AP方向累积转运率存在差异的原因可能与AP→BL、BL→AP方向给药量不同相关。如表5所示，马钱子碱、士的宁在AP→BL方向的转运明显弱于BL→AP方向的转运，C_cum（AP→BL、BL→AP）均随马钱子碱、士的宁转运时间的延长而逐渐增加。如表6所示，加入P-gp抑制剂维拉帕米后，相对于未加维拉帕米的药物组，马钱子碱P_app(BL→AP)显著减小，ER显著减小；士的宁

3  讨论

本研究发现，马钱子碱与士的宁对MDCK-MDR1细胞的毒性都呈质量浓度依赖性，马钱子碱的细胞无毒范围0～0.10 μg/mL，士的宁的细胞无毒范围0～0.04 μg/mL。在质量浓度为0.10、0.20、0.40 μg/mL时，士的宁对MDCK-MDR1细胞的毒性大于马钱子碱对MDCK-MDR1细胞的毒性。陈海波等^[17]研究的马钱子组分对人HaCaT细胞毒性作用的比较，实验结果表明马钱子生物碱组分均对HaCaT细胞存在细胞毒性作用，呈剂量依赖关系，但马钱子碱的细胞毒性明显小于士的宁。本实验的MTT实验结果与文献报道^[17]中的实验结果相符合。

本课题组前期Liu等^[18]对马钱子提取物配伍白芍提取物P-gp调节机制进行了研究，研究表明马钱子碱和士的宁可能是P-gp的底物，白芍提取物配伍马钱子提取物能上调P-gp表达，活化了P-gp功能，增加了马钱子的外排。本实验在此研究的基础上，以马钱子碱与士的宁单一成分为研究对象，进一步阐明马钱子碱与士的宁的转运机制。

口1×10⁻⁵ cm/s；口服吸收良好的药物，其P_app大于1×10⁻⁵ cm/s^[19]。在MDCK-MDR1体外模型中，若ER小于2，则药物的跨膜转运不具方向性，为被动转运^[20]。本实验考察马钱子碱和士的宁在体外细胞膜型MDCK-MDR1的转运特性，研究马钱子碱与士的宁双侧的转运机制，结果表明，马钱子碱、士的宁的P_app值均大于1×10⁻⁵ cm/s，说明马钱子碱、士的宁口服吸收良好。马钱子碱、士的宁的ER均小于2，说明马钱子碱、士的宁主要转运机制为被动扩散。马钱子碱、士的宁在AP→BL侧累积转运率都大于33%和BL→AP侧120 min时累积转运率都大于11%，表明马钱子碱、士的宁吸收良好，口服生物利用度较高^[21]。维拉帕米能抑制P-gp对马钱子碱、士的宁的外排，综上所述，表明马钱子碱、士的宁吸收良好，主要转运方式为被动扩散且可能有外排蛋白p-gp参与。

参考文献（略） 

来  源：胡  亚，刘运锋，朱卫丰，陈丽华，管咏梅，金  晨. 马钱子生物碱类成分在MDCK-MDR1单层细胞模型中的转运机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(12):2876-2883.