食道癌的发病率位居第九，是全世界癌症死亡的第六大原因，因此是一个重大的全球健康挑战。在全球范围内，最常见的食管癌组织类型是食管鳞状细胞癌(ESCC)。食管鳞状细胞癌的预后特别差，往往在疾病的后期被诊断出来，而且一半以上的患者有远处转移。这导致了其5年存活率的下降。近年来，尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但5年生存率仍在15%至20%之间。虽然已有许多基因参与了食管鳞癌的侵袭和转移，但仍缺乏有效的方法来控制疾病的进展。因此，进一步确定作为肿瘤标记物和分子靶点的关键基因，为食管鳞癌的靶向治疗奠定基础非常重要。
本研究采用Transwell法和蛋白免疫印迹法研究了右指蛋白128(RNF128)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的侵袭和运动能力的影响。裸鼠移植瘤模型显示，RNF128能促进ESCC细胞在肺内的转移。信号通路分析表明，表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/基质金属蛋白酶2(MMP-2)级联是RNF128促进ESCC进展的介质。使用EGFR/ERK/MMP-2抑制剂的抑制实验逆转了这一进展。免疫共沉淀显示RNF128通过与p53相互作用和p53与EGFR相互作用促进EGFR/ERK/MMP-2通路的激活。
1. RNF128促进ESCC细胞迁移和侵袭
首先经WB检测了RNF128在9个ESCC细胞中的表达(图S1a)。结果显示，RNF128在低转移的EC109、KYSE270、高转移的KYSE30、KYSE520、EC9706等9个细胞系中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，而KYSE30、KYSE520、EC9706的表达差异无统计学意义(P>0.05)。为探讨RNF128表达与食管癌表型改变之间是否存在因果关系，选择RNF128表达相对较低的KYSE150和KYSE410细胞，建立了RNF128稳定高表达的细胞株。然后，对ESCC细胞的生长和增殖进行了研究。如图S1B，C，RNF128过表达不能使KYSE150和KYSE410细胞具有较强的克隆形成和细胞增殖能力。其次，对食管癌细胞的侵袭和迁移进行了研究。稳定高表达RNF128的细胞株明显获得了增强的细胞迁移和通过细胞外基质涂层的侵袭能力(图1A，B)。RNF128过表达后，E-cadherin水平下降，N-cadherin、vim entin和FN表达上调，提示RNF128调节上皮-间质转化(EMT)的进程(图1C)。
图1.RNF128过表达促进食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的迁移和侵袭
然后选择T.TN和EC9706细胞进行敲减研究，与KYSE410和KYSE150细胞相比，RNF128在这些细胞中的表达相对较高。RNF128的成功敲除在蛋白质水平上得到了验证(图S1D)。在细胞侵袭实验中，发现当RNF128表达下调时，与对照细胞相比，细胞的侵袭能力降低(图2A)。在细胞迁移实验中，观察到随着RNF128表达的降低，细胞迁移能力下降(图2B)。然后，观察到通过RNF128敲除抑制EMT的进展，降低了N-cadherin、波形蛋白和纤维连接蛋白的水平(图2C)。总之，这些数据表明RNF128促进了ESCC细胞的侵袭和转移。
F2.RNF128的敲除抑制了ESCC细胞在体外的迁移和侵袭。
2. 转录组测序证实RNF128激活EGFR/MAPK/MMP-2信号通路
为了更好地了解分子机制，使用转录组测序来筛选KYSE150-Luc和KYSE150-RNF128细胞中的差异调控基因(图3A)。在此基础上，进一步探讨了RNF128在ESCC细胞中作用的分子机制。通过对差异表达基因参与的典型途径进行分析，结果显示EGF和MMP-2表达上调，p53与RNF128和EGFR相互作用，而rNF128和EGFR与p5 3的表达差异无统计学意义，p5 3与rNF12 8和EGFR的相互作用明显增强，而p5 3与rNF128和EGFR的相互作用明显增强。
图3.RNF128通过激活EGFR/MAPK/MMP-2增强MMP-2的表达
3. RNF128通过EGFR/MAPK/MMP-2信号通路促进ESCC细胞的侵袭和转移
为了进一步证实EGFR/MAPK/MMP-2的激活在RNF128诱导的转移中的作用，分析了EGFR的抑制剂吉非替尼、MEK/ERK的抑制剂PD98059和MMP-2的抑制剂对RNF128稳定高表达的ESCC细胞的影响。在稳定高表达RNF128的ESCC细胞中加入吉非替尼后，p-EGFR、p-MEK、p-ERK和MMP-2蛋白的表达减弱，证实吉非替尼成功地抑制了EGFR/MAPK/MMP-2通路(图4A)。PD98059抑制p-MEK、p-ERK和MMP-2的表达(图4B)。如图4C所示，MMP-2抑制剂显著抑制RNF128过表达细胞中MMP-2的表达。随后，还发现，吉非替尼、PD98058和MMP-2抑制剂抑制了KYSE150-RNF128和KYSE410-RNF128细胞的迁移和侵袭能力(图4D，E)。综上所述，这些数据表明RNF128在EGFR/MAPK/MMP-2通路的上游起促进ESCC细胞侵袭和转移的作用。
图4.RNF128促进EGFR/ERK/MMP-2信号通路的活化
4. RNF128通过与p53、p53与EGFR相互作用促进EGFR/MAPK/MMP-2通路的激活
图5.RNF128通过与p53相互作用促进EGFR/MAPK/MMP-2通路的激活
5. RNF128促进肿瘤转移的体内实验研究
进一步证实了RNF128在食管鳞癌转移中的作用，进行了尾静脉转移模型体内实验。与对照组相比，RNF128稳定高表达的ESCC细胞在尾静脉注射后显示出更强的向肺转移的能力，并以肺内较强的生物发光信号为支持(图6A，B)。此外，在RNF128过表达的动物和对照组之间观察到在体重方面的显著差异(图6C)。组织学分析显示，注射过表达ESCC细胞的小鼠肺组织中的转移灶明显增多且较大(图6D)。
图6.RNF128对体内肿瘤转移有促进作用
总之，本项研究揭示RNF128在体内和体外促进食管鳞癌的侵袭和转移中起着重要作用。RNF128调节EGFR/MAPK/MMP-2通路，从而驱动食管鳞癌的侵袭转移。鉴于RNF128在食管鳞癌恶性进展中的重要作用，RNF128有望成为治疗转移性食管鳞癌的新靶点。
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