黄芪多糖对甲醛染毒人骨髓间充质干细胞DNA损伤的保护作用

摘  要：目的  研究黄芪多糖（APS）对甲醛染毒人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）DNA损伤的保护作用及潜在机制。方法 体。

甲醛作为一种环境污染物广泛地存在于汽车尾气、烟草烟雾和各种家居装饰品中，对眼、呼吸、免细胞DNA损伤^[1-2]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymalstem cells，BM-MSCs）是存在于骨髓中的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还能调节造血干细胞的正常增殖和分化^[3-4]。因此，BM-MSCs一旦受损，就会影响骨髓的正常造血，可能导致白血病的发生。黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是黄芪的主要有效成分之一，研究表明，合适浓度的APS能促进人骨髓细胞中红细胞系和粒细胞系祖细胞的生成以及对骨髓抑制的小鼠血常规有改善作用^[5-6]。因此本研究使用甲醛诱导人BM-MSCs DNA损伤，探讨APS对人BM- MSCs DNA损伤的保护作用及潜在机制，为黄芪防治白血病提供实验依据。

1  材料

1.1  细胞

BM-MSCs购自于Cyagen公司，批号HUXMA- 01001。

1.2  药品与试剂

APS（质量分数≥98%，批号SA9790，北京索莱宝科技有限公司）；甲醛（质量分数37%，批号47608，Sigma公司）；DMEM/F-12培养基、胎牛血清（Cyagen公司）；MTT、低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖（Biowest公司）；蛋白酶K（Promega公司）；Hoechst33258、细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；着色性干皮病基因A（XPA）、着色性干皮病基因C（XPC）、DNA修复切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、复制蛋白A1（RPA1）、复制蛋白A2（RPA2）、GAPDH抗体，山羊抗兔IgG（Bioworld公司）；PVDF膜、ECL超敏发光液（Millipore公司）；Trizol总RNA提取试剂盒、第一链cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR mix（德国Qiagen公司）。

1.3  仪器

CO₂细胞培养箱（日本三洋电机公司）；荧光显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；荧光分光光度计（日本岛津公司）；连续波长酶标仪、荧光实时定量PCR（qRT-PCR）仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2  方法

2.1  细胞培养及分组

BM-MSCs用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，置于5% CO₂、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期细胞胰酶消化，接种，随机分为对照组、模型组和APS 组。对照组细胞加入DMEM/F-12培养基，模型组细胞加入含甲醛120 μmol/L的DMEM/F-12培养基，APS组分别加入含APS 和甲醛120 μmol/L的DMEM/F-12培养基。培养24 h后进行后续实验。

2.2  MTT法检测细胞增殖活性

BM-MSCs调整到4×10³个/孔，接种于96孔板，按照“2.1”项进行分组及处理，另设空白组，各孔加入MTT 20 μL，孵育4 h。弃上清，加入DMSO振荡，酶标仪在490 nm处测定吸光度（A）值，计算各组细胞增殖率。

细胞增殖率＝(A_实验-A_空白)/(A_对照-A_空白)

2.3  彗星实验检测DNA链断裂

取对数生长期BM-MSCs，在磨砂载玻片上制备1%的正常熔点琼脂糖凝胶，将细胞悬液与1%的低熔点琼脂糖混匀（体积比1∶3），铺到底胶上，浸入含40%蛋白酶K的裂解液中裂解。然后浸入4 ℃电泳缓冲液中解旋30 min，调节电压15 V，电流300 mA，避光电泳25 min。用1%的H₂O₂固定，碘化丙啶（PI）染色30 min，荧光显微镜观察并进行拍照，应用彗星实验专业分析软件CASP对采集的图片进行分析，每个处理组随机选取20个细胞。釆用国际公认的Olive尾矩（OTM）值对DNA链的断裂进行评价（OTM值＝彗星头尾部密度重心间距离×彗尾DNA含量）。

2.4  KCl-SDS沉淀实验检测DNA-蛋白交联（DPCs）形成

取对数生长期BM-MSCs，加入2% SDS溶液，65 ℃水浴裂解，再加入1 mol/L的KCI充分混匀细胞，冰浴5 min，形成SDS-K⁺沉淀，离心，收集上清和沉淀，此上清中为游离的DNA。将收集的沉淀加入40%蛋白酶K，50 ℃水浴消化，离心收集上清，此上清中为DPCs中的DNA。以小牛胸腺DNA为标准绘制标准曲线。取上述含自由DNA和交联DNA的上清液1 mL，加入Hoechst 33258染色30 min。用荧光分光光度仪在353 nm激发光和455 nm发射光下测得各组的荧光值，根据标准曲线来定量自由DNA和交联DNA浓度，计算DPCs水平。

DPCs＝交联DNA浓度/(交联DNA浓度＋自由DNA浓度)

2.5  qRT-PCR检测XPA、XPC、ERCC1、RPA1、RPA2 mRNA表达

取对数生长期BM-MSCs，根据Trizol法提取细胞总RNA，按照逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书，检测基因表达水平。基因引物序列为GAPDH上游：5’-ATGGT-

2.6  Western blotting法检测XPA、XPC、ERCC1、RPA1、RPA2蛋白表达情况

取对数生长期BM-MSCs，加入200 μL裂解液，细胞刮棒刮取、收集细胞。离心，取上清液，按1∶3加入上样缓冲液，98 ℃煮沸变性，−20 ℃冰箱备用。配制12%聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离蛋白。PVDF转膜后脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃孵育一抗（1∶1 000）过夜，室温孵育二抗（1∶4 000）2 h，ECL发光剂显影成像。用Quantity One图像分析软件分析各目的条带与相应GAPDH的灰度比值，计算各蛋白的相对表达水平。

2.7  统计学分析

实验数据均以表示，采用SPSS 17.0 for Windows软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One-way ANOVA）。

3  结果

3.1  APS对甲醛染毒BM-MSCs增殖活性的影响

MTT结果显示（图1），与对照组比较，模型组细胞增殖活性显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，用APS 40、100、400 μg/mL处理后细胞增殖活性显著升高（P＜0.01），APS 100 μg/mL作用最显著。

3.2  APS对甲醛染毒BM-MSCs DNA断裂的影响

彗星实验结果显示（图2、3），甲醛作用BM-MSCs后，DNA断裂效应较对照组显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，APS 40、100、400 μg/mL干预后，细胞DNA断裂显著减少（P＜0.01），其中APS 100 μg/mL干预效果最为明显，与对照组无明显差异。

3.3  APS对甲醛染毒BM-MSCs DPCs的影响

KCl-SDS沉淀实验结果显示（图4），与对照组比较，甲醛可明显引起BM-MSCs DPCs形成（P＜0.01）。与模型组比较，APS 40、100 μg/mL能明显降低BM-MSCs DPCs水平（P＜0.01）。

3.4  APS对甲醛染毒BM-MSCs XPA、XPC、ERCC1、RPA1、RPA2 mRNA表达的影响

3.5  APS对甲醛染毒BM-MSCs XPA、XPC、ERCC1、RPA1、RPA2蛋白表达的影响

Western blotting结果显示（图6），与对照组比较，模型组细胞中RPA1、RPA2和XPA蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），XPC和ERCC1蛋白表40、100、400 μg/mL

4  讨论

前期研究已证实甲醛可以导致BM-MSCs DNA损伤^[7]。因此，本研究的主要目的是探讨APS对甲醛诱导BM-MSCsDNA损伤的保护作用及机制。首先检测了APS对甲醛染毒BM-MSCs增殖活性的影响，结果发现，APS能够有效提高甲醛染毒BM-MSCs增殖活性，推测APS能够增强DNA复制，从而提高增殖活性。细胞内DNA复制与DNA修复是2个相辅相成的过程，因此本实验通过检测DNA损伤程度评价APS的促DNA修复作用。

DNA断裂和DPCs形成被认为是甲醛导致DNA损伤的主要表现形式，甚至有报道认为，DPCs是甲醛诱导癌变的分子标志，DPCs水平越高，癌变的风险就越高^[8]。本实验通过检测DNA断裂和DPCs形成水平研究甲醛染毒人BM-MSCs DNA损伤的程度，研究发现APS干预组DNA损伤较模型组明显减轻，说明APS能够促进甲醛环境中人BM-MSCsDNA损伤的修复，从而起到保护甲醛染毒人BM-MSCs DNA损伤的作用。

当外界因素作用于机体导致DNA损伤时，为保持自身遗传的稳定性，机体会动员相应的修复机制来逆转这些损伤。核苷酸切除修复（NER）通路是DNA损伤修复机制中一条重要的通路，主要修复DNA的加合物以及链间交联^[9]。XPA和XPC作为DNA损伤识别因子在损伤修复的识别阶段起重要作用，ERCC1主要在对损伤DNA单链片段的切除阶段发挥重要作用，而且ERCC1功能活动的高低可反映整个NER修复活性水平^[10-11]。本研究发现，模型组XPC、ERCC1 mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著升高，说明XPC和ERCC1可能参与了甲醛导致人BM-MSCs DNA损伤的修复。APS各浓度组细胞XPA、XPC、ERCC1 mRNA和蛋白表达水平均较模型组显著升高，提示APS通过上调XPA、XPC、ERCC1 mRNA和蛋白表达从而促进DNA损伤的修复，这与APS明显减轻甲醛染毒人BM-MSCs DNA断裂和DPCs的结果相一致。另外，研究还发现模型组XPA mRNA表达水平较对照组

复制蛋白A（RPA）是由RPA1（RPA70）、RPA2（RPA32）和RPA3（RPA14）3个相关亚基组成的真核单链DNA结合蛋白，在几乎所有的DNA代谢途径中都发挥着重要作用^[12]。RPA不但参与DNA复制的起始和延伸以及冈崎片段的组织，而且还参与NER修复。DNA损伤后，RPA可以保护单链DNA不被核反应降解和发夹形成^[13]，同时，RPA参与DNA损伤识别，RPA复合体中RPA1和RPA2与XPA结合，形成RPA-XPA复合物，保障了NER的顺利进行^[14-15]。本实验发现，RPA1、RPA2 mRNA和蛋白在甲醛作用时表达水平明显下降，说明未参与甲醛导致DNA损伤的修复，而且DNA损伤延滞了细胞周期的进行，会抑制DNA的复制，故复制蛋白RPA1、RPA2表达下降。而APS作用后RPA1，RPA2 mRNA和蛋白表达较甲醛组明显升高，说明APS可能促进RPA1、RPA2与损伤的识别，形成RPA-XPA复合物，从而保证NER的顺利进行。另外，随着DNA损伤的修复，促进了细胞的复制，故复制蛋白RPA1、RPA2表达上升。

本研究还发现APS各质量浓度对甲醛染毒人BM-MSCs的保护作用呈现出先增高后降低趋势，提示APS虽然具有良好的促进DNA损伤修复的功能，但是其使用质量浓度存在一定的合理范围，质量浓度大于100μg/mL时，APS可能会对人BM- MSCs产生毒性影响，加重DNA损伤。然而，体外实验缺少了机体的整体系统，正常情况下，药物在体内要经过吸收、分布、首关效应，其作用效果还受神经内分泌、免疫等复杂因素影响，因此还需体内实验来进一步确定黄芪多糖的有效浓度或者将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系起来。

综上所述，APS对甲醛诱导的BM-MSCsDNA损伤具有显著保护作用，尤其以APS100 μg/mL作用最为明显，可能与上调NER通路的XPA、XPC、ERCC1、RPA1、RPA2基因表达，促进DNA损伤修复有关。但其具体的安全作用剂量范围，还有待进一步研究、明确。

参考文献（略） 

来  源：舍雅莉，刘永琦，孙少伯，赵  翊，李  威，赵腾蛟，李亚玲. 黄芪多糖对甲醛染毒人骨髓间充质干细胞DNA损伤的保护作用 [J]. 中草药, 2019, 50(12):2928-2933.