重楼总皂苷对LiCl诱导人胃癌MKN-45细胞迁移及侵袭的影响

摘  要：目的 探讨重楼总皂苷（Rhizoma Paridis totalsaponin，RPTS）在体外对人胃癌MKN-45细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，探讨其作用的可能机制。方法 体外培养MKN-45细胞，取对数生长期细胞，加入不同质量浓度RPTS（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL）处理24 h，采用MTT法检测细胞增殖情况；细胞划痕实验、Transwell小室实验检测RPTS对MKN-45细胞迁移和侵袭的影响；酶联免疫吸附实验（ELISA）检测RPTS对LiCl诱导的MKN-45细胞上清液中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的上调表达的影响；免疫印迹技术（Western blotting）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分别检

胃癌是最为常见的消化道恶性肿瘤之一，也是发病率和死亡率增长速度最快的恶性肿瘤之一^[1]。全世界每年新发病例有70%在发展中国家，其中我国每年新增病例大约占全球的40%^[2]，且患者趋于年轻化。尽管近年来对于胃癌早期的诊疗技术、外科切除技术以及放化疗和免疫治疗等多种综合治疗技术有所提高，但是患者5年生存率仅为25%～30%^[3-4]，术后胃癌细胞的转移仍然是影响预后和5年生存率的主要因素。如何有效地改善进展期胃癌的浸润和转移仍然是临床上面临的一大难题。目前，众多研究证明中药在抑制肿瘤增殖和转移等方面展现出较高的研究价值。

重楼Rhizoma Paridis以蚤休之名首载于《神农本草经》。其具有清热解毒、消肿止痛的功效。现代植物化学和药理学研究证实从重楼中以醇提方式提取出来的化合物是天然的皂苷类成分，即重楼皂苷（Rhizoma Paridis total saponin，RPTS），也是抗肿瘤的主要活性成分^[5-7]。近年来大量研究展示了RPTS在抑制肿瘤细胞增殖、阻滞癌细胞周期、诱导癌细胞凋亡等方面具有显著的作用^[8-11]。本课题组前期研究发现RPTS具有明显的抑制胃癌细胞增殖的活性^[12-13]。研究表明氯化锂（LiCl）能够抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）、环加氧酶-2（COX-2）等肿瘤侵袭转移相关分子的转录和表达^[14-15]，参与了肿瘤细胞的上皮间质转化，血管生成以及远端转移^[16]。基于以上研究背景，本实验研究RPTS对LiCl诱导的人胃癌MKN-45细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。

1  材料

1.1  细胞

MKN-45细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。

1.2  药物与试剂

重楼饮片购自安徽济仁药业有限公司，产地为云南，批号111012，经安徽中医药大学中药与资源教研室俞年军教授鉴定，确认为云南重楼Paris polyphylla Smith var. yannanensis (Franch) Hand. -Mazz。DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、LiCl（质量分数＞99%）购自美国Sigma公司；Transwell小室（直径8 μm）购自Millipore公司；MMP-9 ELISA试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗体、COX-2抗体、GSK-3β抗体购自美国Cell Signaling公司；TRIzol RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、TRIzol RNA提取试剂、QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3  仪器

Forma 370细胞培养箱（美国Thermo公司）；纯水-超纯水净化器（美国Millipore公司）；7500 Real-Time PCR仪（美国ABI公司）；SPEC-TRAMax M2e酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FCM凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）；PowerPac系列电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

2  方法

2.1  PRTS的制备

2.2  细胞培养

MKN-45细胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度条件下进行培养，待细胞长满至瓶壁85%左右后按照1∶5进行传代，取对数生长期细胞进行各项实验。

2.3  MTT法检测细胞增殖

将处于对数生长期的MKN-45细胞用胰酶常规密度10⁴个/mL，将细胞悬液以200 μL/孔接种于96孔培养板中，在37 ℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别向各孔中加入终质量浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL RPTS，每组6个复孔，另设空白组，继续培养24h，培养结束后每孔加入5 mg/mLMTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清后加入150 μLDMSO，摇床避光震摇15 min，用酶标仪测量各孔在490 nm处的吸光度（A）值，计算细胞活力。

细胞活力＝(A_实验―A_空白)/(A_对照―A_空白)

2.4  细胞划痕实验检测细胞迁移率

取对数生长期的MKN-45细胞，制成单细胞悬液并计数，调整细胞密度至7×10⁵个/mL，接种于6孔板中。置于37 ℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中，待细胞贴壁，用10 μL枪头在孔板底部中央均匀划出一条横线，PBS清洗后，换无血清高糖DMEM培养，并在光学显微镜下观察0 h细胞划痕状态，拍照。之后向各孔中分别加入终质量浓度为0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的RPTS，继续培养24 h，培养结束后在光学显微镜下拍照，观察细胞迁移情况，并计算细胞24 h迁移率。

迁移率＝(划痕宽度_{0 h}－划痕宽度_24h)/划痕宽度_{0 h}

2.5  Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

将Matrigel基质胶置于4 ℃冰箱中隔夜解冻，次日Matrigel基质胶和预冷的无血清DMEM培养液按1∶3稀释混合均匀，在Transwell小室内加入100 μL混合液并均匀铺展，放置在37 ℃恒温培养箱中静置2 h，使基质胶凝固。将Transwell小室置

2.6  ELISA法检测细胞上清中MMP-9的表达

取对数生长期的MKN-45细胞，制成单细胞悬液并计数，调整细胞密度至7×10⁵个/mL，接种至6孔板中。待细胞贴壁后，除对照组外，其余各组细胞加LiCl（5 mmol/L）继续培养24 h，培养结束后换液，加入不同质量浓度RPTS（10、20、40 μg/mL），各组设置3个复孔，继续培养24 h。吸出细胞上清液至1.5 mL EP管中，各组样品和缓冲液按1∶5稀释依次加入MMP-9 Elisa试剂盒当中，每孔50 μL，同时设置标准品组，置于37℃恒温条件下孵育30 min，按说明书操作，酶标仪读取480 nm处A值，记录结果。

2.7  Western blotting法检测细胞中VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表达

将处于对数生长期的MKN-45细胞，制成单细胞悬液并计数，调整细胞密度至7×10⁵个/mL，接种至6孔板中。待细胞贴壁后，除对照组外，其余各组细胞加LiCl（5 mmol/L）继续培养24 h，换液，并加入不同质量浓度RPTS（10、20、40 μg/mL）放入培养箱继续培养24 h。培养结束，弃去上清培，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h。避光配制ECL发光试剂，并均匀涂抹在PVDF膜上蛋白条带对应位置，于FCM凝胶成像仪中自动曝光。所得实验蛋白条带图像经凝胶图像处理系统加以分析。

2.8  qRT-PCR法检测细胞中VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表达

将已接种于6孔板中的MKN-45细胞经过LiCl（5 mmol/L）处理24 h后，加入RPTS（10、20、40 μg/mL）继续处理24 h，收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，取少量RNA进行定量，之后取总RNA 1 μg/μL，用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒将总RNA进行逆转录，生成cDNA。再根据QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR反应。引物序列为β-actin：上游5’-GAGAAAATCTG- GCACGSK-3β：上游5’-GAACTGTCAAG- TAATCCACCTCT-3’，下游5’-CCACGGTCTCCAG- TATTAGCATC-3’；VEGF：上游5’-TCACCAAGGC-

2.9  统计学分析

应用SPSS 19.0对数据进行统计学处理。实验数据以表示，各组指标采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用t检验。

3  结果

3.1  RPTS对MKN-45细胞增殖的影响

MTT实验结果显示，与对照组比较，RPTS 2.5 μg/mL组细胞活力受到影响较小。当RPTS质量浓度增加到5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL时，细胞增殖受到明显的抑制（P＜0.05、0.001），并且随着质量浓度的升高，细胞活力降低。结果见图1。

3.2  RPTS对MKN-45细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与对照组比较，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL组细胞的划痕距离显著增加（P＜0.01、0.001），结果提示RPTS可显著抑制MNK-45细胞的迁移，而且迁移抑制作用呈质量浓度依赖关系，结果见图2。

3.3  RPTS对MKN-45细胞侵袭能力的影响

Transwell小室下室细胞经结晶紫染色，通过对下室细胞数量的观察，可以看出与对照组比较，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL组下室侵袭细胞数量明显减少（P＜0.05、0.001），且表现出质量浓度依赖性，结果提示RPTS能抑制MKN-45细胞的侵袭，结果见图3。

3.4  RPTS对LiCl诱导的MKN-45细胞MMP-9蛋白表达的影响

结果显示（表1），与对照组比较，LiCl可显著提高MKN-45细胞中MMP-9蛋白表达水平（P＜0.05），提示LiCl造模成功。与模型组比较，RPTS 10、20、40 μg/mL可显著抑制MMP-9蛋白的表达，且呈现质量浓度依赖性。

3.5  RPTS对LiCl诱导的MKN-45细胞VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表达的影响

细胞VEGF、COX-2蛋白表达产生了显著的抑制作用（P＜0.01）。RPTS可上调LiCl抑制的GSK-3β蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），提示RPTS。

3.6  RPTS对LiCl诱导的MKN-45细胞VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，与模型组比较，RPTS 10、20、40 μg/mL对LiCl诱导的MKN-45细胞VEGF、COX-2 mRNA表达产生了显著的抑制作用，与Western blotting结果一致。与对照组比较，模型组细胞GSK-3β表达无明显差异，提示LiCl可能仅在蛋白水平调控GSK-3β的表达。与模型组比较，RPTS 20、40 μg/mL组细胞GSK-3β mRNA表达水平明显上调（P＜0.01），结果见图5。

4  讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。胃癌发病有明显的地域性差别，在我国胃癌高发的地区主要集中在东部沿海和中西部的黄河中上游地区。此外，男女发病率为2∶1，并且随年龄的增加而显著升高。据我国肿瘤登记中心最新数据调查结果估计，2015年我国胃癌的新发病例约为67.9万例，胃癌死亡病例约为49.8万例^[22]，因此胃癌已是威胁我国居民健康的主要疾病之一。控制进展期胃癌细胞的高侵袭和高转移性是改善患者预后、减少死亡率的有效途径。本研究发现，RPTS可抑制MKN-45细胞增殖、迁移和侵袭。本研究中选用LiCl作为对MKN-45细胞的外源性诱导物，模拟Wnt/β-catenin信号通路被激活情况下对MKN-45细胞侵袭和转移能力的影响。结果发现LiCl处理细胞24 h后，MKN-45细胞中MMP-9、VEGF、COX-2蛋白的表达显著上调，但RPTS能逆转以上作用，并表现出质量浓度依赖关系。RPTS对LiCl作用位点GSK-3β蛋白也表现出明显的调控作用。

综上所述，RPTS可抑制MKN-45细胞的迁移和侵袭过程，其机制可能与调控细胞Wnt/β-catenin信号通路有关，但具体调控机制还需要进一步探索和研究，为更多的临床应用提供参考。

参考文献（略） 

来  源：洪星辉，王  靓，梁梦茹，黄金玲. 重楼总皂苷对LiCl诱导人胃癌MKN-45细胞迁移及侵袭的影响 [J]. 中草药, 2019, 50(13):3134-3139.