iRIP-seq研究RBP技术

生命之美自主开发的技术

专注RNA调控为核心的表观基因组和功能基因组研究

中心法则的确立加速了分子生物学的发展，RNA作为中心法则中重要的要素之一，一直受到学术界的高度关注。目前已发现了多种功能化的RNA，包含传递遗传信息的mRNA，负责翻译蛋白的tRNA和rRNA，具有特殊调控功能的细胞核小RNA（snRNA）， micro-RNA， ncRNA （LncRNA， circRNA）等等。因此，RNA的功能已经远远超出了作为遗传信息传递中介的作用，RNA发挥功能的过程中，与靶分子的结合是关键的一步。如何分析鉴定到真实的RNA与蛋白的相互作用是探索RNA功能的关键。

图1 RBP调控RNA的命运（来自Martin et al., 2018）

以蛋白为核心来研究相互作用的RNA分子是常见的方法，目前已发展出多种这类的研究技术，包括体内（in vivo）研究的RIP（RNA immunoprecipitation）和CLIP（cross-linking and immunoprecipitation）技术及其各种衍生技术（例如HiTS-CLIP，PAR-CLIP，iCLIP，eCLIP等）。

表1 以蛋白质为核心的RNA-蛋白相互作用研究方法汇总（来自Lee et al.,2018）

RIP是最常见的基因蛋白研究RNA-蛋白相互作用的技术，该技术是全基因组水平的检测技术，但由于蛋白质-rna复合物在溶液中的非生理形成，它很容易检测到非特异性的相互作用(Marchese et al., 2016)， RIP获得的结果往往需要进一步的验证。RIP实验的不足可以通过基于交联的技术体系纠正，也就是CLIP实验。

CLIP实验基于紫外交联（UV-crosslinking）条件，将生理条件下有相互作用的RNA与蛋白交联在一起，在通过SDS-PAGE等技术分离RNA样品，可进一步通过测序等技术进行进一步的鉴定。根据实验条件和产物鉴定程序，CLIP实验技术细分为多种：如果获得的RNA样品反转录后进行深度测序，称之为HiTS-CLIP（high-throughput sequencing of cDNA library），基于光激活核苷的增强型CLIP，PAR-CLIP（Photoactivable ribonucleoside enhanced CLIP），单核苷酸分辨率的CLIP，iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），优化的CLIP，eCLIP（enhanced CLIP）。HiTS-CLIP的优点是可以全基因组水平的筛选鉴定，不足是因为交联条件限制而出现假阴性结果。PAR-CLIP的分辨率很高，但非常耗时间。iCLIP的分辨率很高，但实验技术操作要求非常高。eCLIP通过改善实验流程，在不降低CLIP的碱基分辨率精度下简化了实验耗时。目前已有102项eCLIP的报道，涉及73种RNA结合蛋白。

图2 eCLIP技术实验流程（来自Gene W Yeo et al., 2016）

Clip-seq技术流程复杂，步骤繁琐，需要特殊的仪器设备，因此，实验的成功率和可重复性都比较低。同时需要使用放射性元素32P标记的方法指示蛋白质-RNA复合物的位置，同位素对人体会有危害，国家对同位素使用管理严格，普通的实验室没有资质去申请同位素。iRIP-seq(Improved RIP-seq)是生命之美公司自主开发用于研究RBPs的新技术，将Clip-seq技术中的紫外交联（UV-crosslinking）和MNase酶切实验加入到传统RIP技术中，同时用CLIP-seq数据分析流程获得RBP结合的peaks和Motif信息。该技术既实现了Clip-seq的精准度，准确获得RNA和蛋白质的结合位点，又保留了RIP-seq 简单性。

图3 iRIP-seq技术实验流程

合作案例

FOXN3是一种转录抑制因子，SIN3A是ER+细胞（雌激素受体阳性细胞）中的一种抑制因子复合物，本文作者通过研究FOXN3的病理学功能机制，发现FOXN3这种转录因子与SIN3A会发生蛋白质之间的互相作用，并且这种互作需要由乳腺癌细胞中的雌激素诱导产生的NEAT1（一种Long noncoding RNAs）的参与。为了研究介导FOXN3和SIN3A复合体互相作用的RNA，使用了iRIP-seq技术（生命之美自主开发的技术，基于RIP-seq的改进版）最终通过两种数据分析方法（Piranha和CIMS）筛选出两种lncRNA，NEAT1和MALAT1（图4A和4B），然后再通过对NEAT1和MALAT1敲除和过表达后进行CoIP检测的方法确定了NEAT1是FOXN3和SIN3A互作所必需的（图4C）。在小鼠体内实验证实FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物促进癌细胞肺转移（图4D）。

图4 iRIP-seq在研究FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物机制和功能中的运用（来自Li et al.,2016）

References

(Lee and Ule, 2018; Li et al., 2017; Turner and Diaz-Munoz, 2018; Van Nostrand et al., 2016)

Lee, F.C.Y., andUle, J. (2018). Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Mol Cell 69, 354-369.

Li, W., Zhang, Z., Liu, X., Cheng, X., Zhang, Y., Han, X., Zhang, Y., Liu, S., Yang, J., Xu, B., et al. (2017). The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer. J Clin Invest 127, 3421-3440.

Marchese, D., de Groot, N.S., Lorenzo Gotor, N., Livi, C.M., and Tartaglia, G.G. (2016). Advances in the characterization of RNA-binding proteins. WIREs RNA 7, 793-810.

Turner, M., and Diaz-Munoz, M.D. (2018). RNA-binding proteins control gene expression and cell fate in the immune system. Nat Immunol 19, 120-129.

Van Nostrand, E.L., Pratt, G.A., Shishkin, A.A., Gelboin-Burkhart, C., Fang, M.Y., Sundararaman, B., Blue, S.M., Nguyen, T.B., Surka, C., Elkins, K., et al. (2016). Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods 13, 508-514.

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撰稿 = 薛亚强

编辑 = 云隆

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