摘要
鼻咽癌 (NPC) 具有局部浸润率高、早期远处转移率高等特点。越来越多的证据表明，表观遗传异常在鼻咽癌发展中起重要作用。然而，鼻咽癌转移的表观遗传学机制仍不清楚。在这里，我们研究了鼻咽癌组织中异常甲基化的转录因子，我们确定HOP同源盒 HOPX 是最显著的高甲基化基因。我们发现 HOXP 在鼻咽癌组织和细胞系中的表达下调。恢复 HOPX 的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移并增强其化疗敏感性。这些效应是由HOPX 介导的SNAIL转录的表观遗传沉默通过增强SNAIL 启动子中的组蛋白 H3K9 去乙酰化而介导的。而且，我们发现高甲基化水平的 HOPX 患者在训练和验证队列中表现出较差的临床结果。
研究结果
图1
图1：HOPX 在鼻咽癌中高度甲基化。
(a) 正常鼻咽上皮组织（正常，n¼24）和鼻咽癌组织 (n¼24) 中前 10 个差异甲基化 TFs CpG 位点的热图聚类。
列：单个样本；
行：CpG 位点；
蓝色：低甲基化；
黄色：高甲基化。
(b) HOPX 启动子中 CpG 岛和重亚硫酸盐焦磷酸测序区域示意图。
输入序列：红色区域；
CpG 岛：蓝色区域；
TSS：转录起始位点；
cg21899596、cg24852548 和 cg10800833：在我们以前的全基因组甲基化芯片中鉴定出的 HOPX 的 cg 位点；
洋红字：用于重亚硫酸盐焦磷酸测序的 cg 位点；
粗洋红字：HOPX 中最显著改变的 cg 位点。
(c，d) HOPX 启动子区域的重亚硫酸盐焦磷酸测序分析(c)和正常和组织中的平均甲基化水平 (d)。洋红色词：CG site of cg21899596。
图2
图2：鼻咽癌中 HOPX 表达减少与其启动子超甲基化有关。
(a) 实时荧光定量 RT-PCR 分析正常和鼻咽癌组织中 HOPX mRNA 的相对表达。
(b，c) 正常组织 (n¼6)、无 (LN，n¼10) 或有 (LN，n¼10) 区域淋巴结转移的原发性鼻咽癌组织和有远处转移的原发性鼻咽癌组织 (DM，n¼10) 中 HOPX 的免疫组织化学染色 (200) (b) 和统计学分析 (c)。比例尺：100 mm；均数±标准差；Student t 检验。
(d,e) 通过实时 RT-PCR 和 western blotting 测量 NPEC 和 NPC 细胞系中 HOPX 的 mRNA 和蛋白水平。平均值±标准差；*Po0.01 与 NP69 相比；Student’s t 检验。
(f,g) HOPX 甲基化水平通过重亚硫酸盐焦磷酸测序分析 (f) 和相对 HOPX mRNA 水平通过实时 RT–PCR 分析 (g) 用 (DAC) 或不用 (DAC) DAC 处理 NPEC 和 NPC 细胞株。平均值±s.e.m.；*Po0.01，与DAC相比；Student t 检验。这些数据代表三个独立的实验。
图3
图3：HOPX 在体外抑制NPC细胞迁移和侵袭。
(a-c) 在稳定过表达载体或 HOPX 的 CNE2 和 SUNE1 细胞中，用伤口愈合实验 (200) (a) 和没有基质胶的Transwell 实验(200) (b) 测量迁移能力。侵袭能力用 Matrigel(200) (c) Transwell 实验检测。比例尺，100 mm；均数±标准差；*Po0.01 与向量相比；Student’s t-检验。
(d–h) 在 N2-Tert 和 NP69 细胞瞬时表达对照 NC 或 HOPX-siRNAs（si-1 和 si-2），使用伤口愈合试验 (200) (d) 和没有基质胶的 Transwell 试验 (200) (e，f) 测量迁移能力。侵袭能力采用 Transwell 实验，Matrigel (200;g,h)。比例尺，100 mm；平均值±s.d.；*Po0.01（与 NC 相比）；Student t 检验。这些数据代表三个独立的实验。
图4
图4：HOPX 招募 HDAC 活性到 SNAIL 启动子，表观遗传学上抑制鼻咽癌中 SNAIL 的转录。
(a-d) Real-timeRT–PCR(a,b)和western blotting
(c,d) 检测用于检测 CNE2 和 SUNE1 细胞中 SNAIL 的 mRNA 和蛋白水平稳定过表达载体或 HOPX，或转染对照 NC 或 HOPX-siRNAs（si-1 和 si-2）的 N2-Tert 和 NP69 细胞。平均值±标准差；*P<0.01 与载体或 NC 比较；Student t 检验。
(e) 转染pGL3-SNAIL启动子的 CNE2 和 SUNE1 细胞与载体或 HOPX 共转染，进行双荧光素酶报告基因检测。Mean±s.d.；*P<0.01 与 vector 比较；Student’s t 检验。
(f) ChIP 实时 PCR 分析用来评估 CH,SH,NP69 和 N2-Tert 细胞中 SNAIL启动子区域的HOPX 富集.Mean±s.d.；*P<0.01 与IgG比较；Student’s t-检验。
(g) 在CH，SH，NP69 和 N2-Tert 房间通过 Co-IP 试金检验了在 HOPX 和 HDAC2 之间的物理相互作用；WB：西方的弄污试金。Mean±s.d.；*P<0.01 与 vector 比较。
(j) 实时 RT–PCR 用来评估用 TSA (0,50 or 100 nM) 处理的稳定过表达载体或 HOPX 的 CNE2 和 SUNE1 细胞中相对 SNAIL mRNA 的表达。平均值±s.d.；*P<0.01与TSA (0 nM) 相比；Student t 检验。CH和SH细胞表明CNE2和 SUNE1 细胞具有稳定的 HOPX 过表达。这些数据代表三个独立的实验。
图5
图5：HOPX 高甲基化与鼻咽癌预后不良相关。通过重亚硫酸盐焦磷酸测序分析测定 HOPX 甲基化水平。根据鼻咽癌患者 HOPX 甲基化水平（低甲基化与高甲基化）进行 Kaplan—Meier 分析，确定 DMFS、OS 和 DFS，训练集中 255 例鼻咽癌患者的 (a—c) DMFS (a)、OS (b) 和 DFS (c)，验证集中 188 例鼻咽癌患者的 (d—f) DMFS (d)、OS (e) 和 DFS (f)。采用校正的单因素 Cox 比例风险模型计算 HR 值和 P 值。
总结
HOPX 通过 SNAIL 转录的表观遗传调控起到肿瘤抑制因子的作用，为鼻咽癌转移提供了新的预后生物标志物，为鼻咽癌治疗提供了新的治疗靶点。
DOI：10.1038/ncomms14053
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