研究结果
图1
图1：抑制 NEAT1 可抑制前列腺癌细胞的细胞增殖和肿瘤发生。
(A，B) PC3 (A) 和 DU145 细胞 (B) 用 siRNAs 进行基因沉默后的生长曲线。
(C)Tet-on CRISPR-Cas9-PC3 细胞的生长曲线。转染 sgRNA 后用 20µg/ml 多西环素诱导 Cas9 的表达。
(D) 雄性 BALB/c 小鼠的异种移植肿瘤模型的图像、体积和重量，这些小鼠是由稳定 Tet-on CRISPR/Cas9 基因沉默的 PC3 细胞建立的。误差条代表平均值±SD。进行了 Student t 检验，以计算两组肿瘤体积或重量之间差异的统计学显著性（P 值）。
图2
图2：抑制 NEAT1 诱导了 DNA 损伤反应和细胞周期阻滞。
(A) 热图显示用 siRNA 敲除 NEAT1 后 PC3 细胞中显著上调和下调的基因的相对表达（z 值）。根据 log2 倍数变化 > 1或<-1 和校正的p值 < 0.05 的标准选择基因。
(B) PC3 细胞中 NEAT1 敲低后下调基因集中 GO 和 KEGG 功能注释的富集。富集的P值 (-log10) 见 y 轴。
(C) PC3 和 DU145 细胞中 NEAT1 敲除后 γ-H2AX 的蛋白免疫印迹分析，DNA 损伤的标记物。
(D) 用 siRNA 沉默 PC3 细胞中 NEAT1 后，用 TUNEL 法检测 DNA 损伤。
(E) 用无嘌呤/无嘧啶 (AP) 位点定量 DNA 损伤。误差条代表平均值±SD。进行 Student t 检验以计算统计学显著性（P 值）。
(F) PI 染色细胞后，通过 FACS 评估细胞周期阶段。
图3
图3：NEAT1 调节 CDC5L 的转录活性。
(A) 预测其对靶基因转录作用依赖于 NEAT1 水平的前14个TFs。提供了支持该结论的靶基因数量。
(B) NEAT1和 U1 通过 UV 交联 IP 与 CDC5L 特异性抗体进行定量。阴性对照包括含 IgG 的下拉和无 UV 交联的下拉。误差条代表平均值±SD。
(C) 作为阳性对照，CDC5L 或 SFPQ 与 NEAT1 在 PC3 细胞核中的共定位。用RNA-FISH和 CDC5L或SFPQ 减少 NEAT1 的染色，用抗体免疫荧光检测。
(D) 敲除 NEAT1 后用双荧光素酶报告系统定量 CDC5L 的转录活性。使用 pRL-TK 作为双荧光素酶报告基因检测的阴性对照。CMV 基序构建的荧光素酶表达质粒作为实验的阳性对照。误差条代表平均值±SD。进行 Student t 检验以计算统计学显著性（P 值）。
(E) CDC5L 和 paraspeckle 标记物 PSPC1 在细胞核中的共定位。通过免疫荧光染色观察蛋白。
图4
图4：沉默 CDC5L 抑制前列腺癌细胞生长并诱导 DNA损伤。
(A) 用siRNAs沉默 CDC5L的PC3(左)和 DU145（右）细胞的生长曲线。误差线表示平均值±SD。对于siNC和siCDC5L之间的差异，Student t 检验的 P 值均低于0.0001。
(B) PC3和DU145细胞中CDC5L沉默后 γ-H2AX（DNA损伤的标志物）的 Western blotting 检测。
(C) 用无嘌呤/无嘧啶 (AP) 位点定量 DNA 损伤。误差条代表平均值±SD。进行 Student t 检验以计算统计学显著性（P 值）。
(D) 基因敲除和不基因敲除NEAT1过表达CDC5L 的 PC3 细胞的生长曲线。用 20µg/µl 多西环素诱导 Cas9 表达。
(E) Western blots 显示 γ-H2AX 的水平，一个 DNA 损伤的标记物，NEAT1 的可诱导基因敲除伴或不伴 CDC5L 过表达。
图5
图5：AGRN 作为 CDC5L 靶点的鉴定及其对 NEAT1 的依赖性。
(A) Gene set enrichment analysis (GSEA) 显示ChIP-seq鉴定出的CDC5L靶基因的 Gene-set 中 NEAT1 沉默后差异表达基因的富集具有统计学意义。
(B) qPCR 分析 PC3 和 DU145 细胞中 CDC5L 沉默后10个基因的表达。选择这10个基因，因为它们被 ChIP-seq 鉴定为 CDC5L 靶标，并在 NEAT1 沉默后显示差异表达。
(C) qPCR 分析显示 AGRN 在基因敲除 NEAT1 (KO) 后被抑制，这可以通过过表达 CDC5L 来挽救。误差线表示平均值±SD。
总结
我们已经确定了 NEAT1 在前列腺癌细胞中的重要致癌作用需要 CDC5L-AGRN 环路。
DOI：10.1158/0008-5472.CAN-18-0688
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